Matja e aftësisë së AI për të përshpejtuar kërkimet biologjike në laborator për lëngje

Përshpejtimi i përparimit shkencor është një nga mënyrat më të vlefshme që AI mund të vijë në dobi të njerëzimit. Me GPT‑5, po fillojmë të shohim shenja të hershme⁠ të kësaj — jo vetëm në ndihmën për studiuesit që të lëvizin më shpejt nëpër literaturën shkencore, por edhe në mbështetjen e formave të reja të arsyetimit shkencor, si zbulimi i lidhjeve të papritura, propozimi i strategjive të provës, ose sugjerimi i mekanizmave të mundshëm që ekspertët mund t'i vlerësojnë dhe testojnë.

Përparimi deri më sot ka qenë më i dukshëm në fusha si matematika, fizika teorike dhe shkenca kompjuterike teorike, ku idetë mund të verifikohen në mënyrë rigoroze pa eksperimente fizike. Biologjia është ndryshe: shumica e përparimeve varen nga ekzekutimi eksperimental, përsëritja dhe verifikimi empirik në laborator.

Për të ndihmuar në kuptimin e sjelljes së modeleve pararojë në këto mjedise, ne punuam me Red Queen Bio, një start-up në fushën e biosigurisë, për të ndërtuar një kuadër vlerësues që teston se si një model propozon, analizon dhe përsërit idetë në laboratorin e lagësht. Ne krijuam një sistem eksperimental të thjeshtë të biologjisë molekulare dhe përdorëm GPT‑5 për të optimizuar një protokoll të klonimit molekular për efikasitet.

Gjatë disa raundeve të eksperimentimit, GPT‑5 prezantoi një mekanizëm të ri që përmirësoi efikasitetin e klonimit me 79x. Klonimi është një mjet themelor i biologjisë molekulare. Efikasiteti i metodave të klonimit është thelbësor për krijimin e bibliotekave të mëdha dhe komplekse që janë qendrore për inxhinierinë e proteinave⁠(hapet në një dritare të re), ekranet gjenetike⁠(hapet në një dritare të re), dhe inxhinierinë e shtameve organizmale⁠(hapet në një dritare të re). Ky projekt ofron një pasqyrë se si AI mund të punojë krah për krah me biologët për të përshpejtuar kërkimet. Përmirësimi i metodave eksperimentale do t'i ndihmojë studiuesit të lëvizin më shpejt, të ulin kostot dhe të shndërrojnë zbulimet në ndikim të prekshëm në botën reale.

Për shkak se përparimet në arsyetimin biologjik kanë implikime për biosigurinë, ne e kryem këtë punë në një mjedis të kontrolluar rreptësisht — duke përdorur një sistem eksperimental të padëmshëm, duke kufizuar fushën e detyrës dhe duke vlerësuar sjelljen e modelit për të informuar vlerësimet tona të rrezikut të biosigurisë dhe zhvillimin e masave mbrojtëse në nivelin e modelit dhe sistemit, siç përshkruhet në Kuadri ynë i Gatishmërisë⁠(hapet në një dritare të re).

Në këtë konfigurim, GPT‑5 arsyetoi në mënyrë autonome për protokollin e klonimit, propozoi modifikime dhe inkorporoi të dhëna nga eksperimente të reja për të sugjeruar përmirësime të tjera. E vetmja ndërhyrje njerëzore ishte që shkencëtarët të zbatonin protokollin e modifikuar dhe të ngarkonin të dhënat eksperimentale.

Gjatë disa raundeve, GPT‑5 optimizoi procedurën e klonimit për të përmirësuar efikasitetin mbi 79 herë — që do të thotë se për një sasi të caktuar të ADN-së së inputit, ne rikuperuam 79 herë më shumë klone të verifikuara me sekuencë sesa protokolli bazë. Veçanërisht, ai prezantoi dy enzima që përbëjnë një mekanizëm të ri: rekombinaza RecA nga E. coli, dhe proteina e lidhjes me ADN-në me një fije të gjenit 32 të fagut T4 (gp32). Duke punuar në varg, gp32 zbut dhe shthur skajet e lira të ADN-së, dhe pastaj RecA drejton çdo fije drejt përputhjes së saj të saktë.

Edhe pse janë paraprake, këto rezultate janë inkurajuese. Përmirësimet janë specifike për konfigurimin tonë të veçantë të klonimit të përdorur në sistemin tonë model, dhe ende kërkojnë që shkencëtarët të vendosin dhe të ekzekutojnë protokollet. Megjithatë, këto eksperimente tregojnë se sistemet e AI mund të ndihmojnë në mënyrë domethënëse punën reale laboratorike dhe mund të përshpejtojnë punën e shkencëtarëve në të ardhmen.

Është për t'u theksuar se cikli i laboratorit të AI u ekzekutua me kërkesa fikse dhe pa ndërhyrjen e njeriut. Ky skelet ndihmoi në zbulimin e aftësisë së modelit për të propozuar ndryshime vërtet të reja të protokollit në mënyrë të pavarur nga udhëzimet njerëzore, por gjithashtu e bllokoi sistemin në eksplorim dhe i kufizoi aftësinë për të maksimizuar performancën e ideve të sapozbuluara. Një ekuilibër më i mirë dinamik midis eksplorimit dhe shfrytëzimit ka të ngjarë të sjellë përfitime më të mëdha, pasi si përmirësimet enzimatike ashtu edhe ato të transformimit kanë hapësirë të konsiderueshme për përmirësim. Ne presim që përparimet në planifikim dhe arsyetimin e horizontit të detyrave të përmirësojnë aftësinë e kërkesave të thjeshta fikse për mbështetje si të zbulimit ashtu edhe të optimizimit pasues.

Reaksioni Formimi Gibson⁠(hapet në një dritare të re) ka qenë një metodë kryesore e klonimit që nga shpikja e saj në vitin 2009, me adoptim të gjerë në biologjinë molekulare. Formimi Gibson u mundëson biologëve molekularë të "ngjisin" pjesë të ADN-së së bashku duke shkrirë përkohësisht skajet e tyre në mënyrë që sekuencat përputhëse të mund të bashkohen në një molekulë të vetme. Një atribut kryesor i formimit Gibson është thjeshtësia e tij: gjithçka ndodh në një epruvetë të vetme në një temperaturë. Këto kufizime natyrisht lënë hapësirë për përmirësim. Përveç kësaj, karakteristikat e mëposhtme e bëjnë të përshtatshëm për të vlerësuar aftësitë e modeleve të AI për të përmirësuar teknikat e laboratorit të lagësht.

• I mirëpërcaktuar me komponentë të kontrolluar, ndryshe nga një sistem i bazuar në qeliza
• Ka një funksion të qartë optimizimi: ADN e rrethuar e transformueshme e bërë nga një sasi fikse e inputeve të ADN-së lineare
• Cikle eksperimentale relativisht të shpejta (1-2 ditë)
• Hapësira e projektimit me dimensione të larta që kërkon arsyetim mekanistik për përmirësim: tamponët optimalë, reagentët dhe temperaturat janë të gjitha të ndërlidhura.

Ne përdorëm formimin Hi-Fi⁠(hapet në një dritare të re), një sistem enzimatik i patentuar i zhvilluar nga New England Biolabs dhe i bazuar në formimin Gibson, si një pikë fillestare për optimizim. Ne eksploruam nëse një AI mund të novatorizojë dhe të mësojë nga përshtypjet eksperimentale pasi kufizimet njëhapëshe dhe izotermike u hoqën, dhe kështu të identifikojë përmirësimet e protokollit në këtë skenar.

Konkretisht ne kryem një reaksion klonimi me dy pjesë duke përdorur një gjen për proteinën e gjelbër fluoreshente (GFP) dhe plazmidin e përdorur gjerësisht pUC19, një "vektor" standard i ADN-së që përdoret për të transportuar gjene në baktere në mënyrë që ato të mund të kopjohen. Qëllimi ishte të rritej numri i kolonive të suksesshme.

Ne optimizuam reaksionin e klonimit duke sjellë një kornizë evolutive për iteracionin e propozimeve, duke i mundësuar modelit të mësojë "në linjë" nga eksperimentet e veta të kaluara. Në çdo raund, GPT‑5 propozonte një grup prej 8-10 reaksionesh të ndryshme, ku reaksionet shtyheshin në raunde të mëvonshme nëse kërkonin reagentë të personalizuar që laboratori nuk i kishte menjëherë në dispozicion. Shkencëtarët më pas kryen reaksionet dhe matën numrin e kolonive në krahasim me formimin bazë HiFi Gibson në një test fillestar. Të dhënat me performancën më të mirë nga raundi i mëparshëm u përdorën më pas në raundin pasues. Është e rëndësishme që kërkesat u standardizuan pa input nga njeriu përveç pyetjeve sqaruese, duke na lejuar të atribuojmë njohuri të reja mekanistike drejtpërdrejt tek AI dhe jo te udhëzimet njerëzore. 

Ritestuam tetë reaksionet kryesore nga seria e plotë e optimizimit duke përdorur një gamë më të gjerë të hollimeve të ADN-së dhe zbuluam se shumë prej tyre treguan efekte më të vogla se në ekranin fillestar; në fund, kandidati më i fortë i verifikuar ishte një reaksion nga raundi i pestë që riprodhoi performancën e tij origjinale. Shumë performues të lartë ranë në familjen ligazë-optimizim, e cila duket veçanërisht e ndjeshme ndaj variacioneve të vogla në gjendjen e qelizave kompetente dhe/ose trajtimit të ADN-së pas reaksionit. Për shkak se këto reaksione përdorën një hap të shkurtër HiFi, ne hipotezojmë se shumë produkte ka të ngjarë të hyjnë në E. coli me vetëm një nyjë të mbyllur dhe tjetrën të mbajtur me ngjitje, duke ua lënë shpëtimin e mëtejshëm rrugëve të riparimit qelizor. Kjo krijon variancë të lartë dhe një dinamikë "jackpot": edhe nëse shumicën e kohës variantet e këtij reaksioni nuk performojnë më mirë, një anomali e fortë mund ta çojë familjen në raundet pasuese. 

Ndërsa u përqendruam në optimizimin e reaksionit të klonimit gjatë raundeve për shkak të kompleksitetit të tij mekanistik, paralelisht optimizuam procedurën e transformimit duke përdorur një raund të vetëm "one-shot" ku modeli propozoi shumë ndryshime të pavarura, dhe ne morëm reaksionin me performancën më të mirë.

Duke përdorur kërkesa të standardizuara pa ndërhyrje njerëzore, GPT5 përmirësoi efikasitetin e klonimit nga fillimi në fund 79 herë, e konfirmuar nëpërmjet përsëritjeve eksperimentale.

Në veçanti, modeli propozoi një procedurë të re enzimatike, të cilën e quajti formim RecA-Assisted Pair-and-Finish HiFi (RAPF-HiFi), që shton dy proteina të reja në reaksion: rekombinaza RecA nga E. coli, dhe proteina e lidhjes së ADN-së me një fije të vetme nga gjeni 32 i fagut T4 (gp32). Për më tepër, modeli bëri modifikime të qëllimshme në temperaturën dhe kohën e inkubacionit, si dhe në kohën e shtesave enzimatike: ai propozoi shtimin e RecA dhe gp32 pas një reaksioni fillestar HiFi në 50°C, duke lejuar që këto proteina të punojnë në 37°C, dhe pastaj duke u kthyer prapa në 50°C për të përfunduar formimin. Së bashku, këto modifikime të reja rritën efikasitetin mbi 2,5 herë. Duhet të theksohet se kjo përfaqëson performancën fillestare pa optimizim iterativ të kushteve të reaksionit dhe kohës.

Në aspektin e transformimit, modifikimi më efektiv doli të ishte papritur i thjeshtë: peletimi i qelizave (rrotullimi i tyre në një centrifugë që të mblidhen në fund të epruvetës), heqja e gjysmës së vëllimit të dhënë dhe risuspendimi i qelizave para se të shtohet ADN-ja, të gjitha në 4°C. Ndërsa qelizat kimikisht kompetente me efikasitet të lartë zakonisht konsiderohen të brishta, qelizat i toleruan mirë përqendrimin dhe përplasjet e shtuara molekulare rritën ndjeshëm efikasitetin e transformimit (më shumë se 30 herë në verifikimin përfundimtar). 

Formimi Gibson funksionon duke u dhënë pjesëve të ADN-së skaje “ngjitëse” që të mund të gjejnë njëra-tjetrën dhe të bashkohen. Reaksioni përdor dy enzima të ndryshme (një polimerazë dhe një ligazë) për të mbyllur pjesët e bashkuara. Në RAPF-HiFi, u prezantuan dy proteina për të përmirësuar hapin e përputhjes. I pari, gp32, vepron si një krehër që rregullon dhe zgjidh skajet e lira të ADN-së. I dyti, RecA, vepron si një udhëzues që kërkon partnerin e duhur për çdo fije dhe tërheq pjesët që përputhen së bashku. Temperatura më e lartë bën që të dy ndihmësit të shkëputen nga ADN-ja, duke lejuar që enzimat normale Gibson të përfundojnë reaksionin.

Në përmbledhje, ne supozojmë se përmirësimi i performancës ndërmjetësohet përmes mekanizmit të mëposhtëm:

• Gp32 mbulon bishtat e ADN-së me një fije të vetme (ssDNA) të pangjitur, duke hequr strukturën dytësore
• RecA, zakonisht i penguar nga struktura, hyn nga 3' dhe zhvendos filamentin gp32
• RecA ndërmjetëson një kërkim për homologji ssDNA:ssDNA⁠(hapet në një dritare të re), duke nxitur lidhjen
• Një kthim në 50°C zhvendos si filamentet recA ashtu edhe ato gp32, duke lejuar polimerazën dhe ligazën të përfundojnë reaksionin.

Për të testuar nëse enzimat e reja ishin funksionale dhe për të përjashtuar që përmirësimi i performancës të jetë i nxitur vetëm nga ndryshimet në hapat termikë ose tamponët, ne testuam performancën e RAPF-HiFi pa RecA dhe pa të dy, RecA dhe gp32. Performanca e të dy reaksioneve u zvogëlua në krahasim me RAPF-HiFi, duke sugjeruar se të dy proteinat janë të nevojshme për mekanizmin e veprimit të RAPF-HiFi.

Zhvillimi RAPF-HiFi sugjeron se GPT‑5 është i aftë për arsyetim kompleks, shumëdimensional:

• RecA është i penguar nga struktura e ADN-së⁠(hapet në një dritare të re), dhe është e dukshme që modeli prezantoi dy modifikime sinergjike njëherësh: shtoi RecA dhe e plotësoi me gp32 për të hequr strukturën dytësore të ADN-së.
• Partneri natyror i E. coli RecA është proteina lidhëse me një fije të vetme e E. coli (SSB). SSB kryen një rol të ngjashëm me gp32 gjatë replikimit, rikombinimit dhe riparimit të gjenomit. Megjithatë, E. coli SSB nuk largohet spontanisht nga ADN-ja mjaft shpejt për rritjen e filamentit RecA, ndërsa kompleksi RecFOR promovon bërthamëzimin e RecA në filamentin SSB in vivo⁠(hapet në një dritare të re). SSB lidhet si një tetramer i qëndrueshëm me shkallë jashtëzakonisht të ngadalta të largimit⁠(hapet në një dritare të re). Për kontrast, filamenti gp32 është më dinamik⁠(hapet në një dritare të re), duke lejuar zhvendosjen e RecA. 

Sipas njohurive tona, RecA dhe gp32 nuk janë përdorur së bashku në mënyrë funksionale në metodat e biologjisë molekulare. Ashtu si me shumë teknika të reja të biologjisë molekulare, aktivitetet biokimike themelore ishin studiuar tashmë, por përdorimi i tyre si një metodë praktike dhe e përgjithshme përbën avancimin.

Për shembull, ndërveprimi i RecA dhe gp32 është studiuar në eksperimente mekanistike të rikonstruksionit in vitro: në studimet e formimit të D loop, u tregua se gp32⁠(hapet në një dritare të re) është i aftë të përmirësojë aktivitetin e RecA. Gp32 është përdorur në bashkëpunim me partnerin e tij natyral të rekombinazës T4, UvsX, dhe faktorin e ngarkimit të rekombinazës uvsY në amplifikimin e polimerazës së rekombinazës (RPA⁠(hapet në një dritare të re)). Megjithëse një specifikim i patentës RPA thotë⁠(hapet në një dritare të re) se reaksionet efektive të RPA janë demonstruar duke përdorur E. coli RecA në një sistem heterolog me një proteinë gp32 të kompromentuar (d.m.th., të inxhinieruar, jo të tipit të egër), ky pohim shfaqet vetëm si një tangjent në disa zbulime patentash dhe, sipas njohurive tona, nuk është mbështetur nga të dhëna të publikuara ose nuk është adoptuar si një sistem i fuqishëm RPA i bazuar në RecA. Një metodë klonimi e quajtur SLiCE⁠(hapet në një dritare të re) përdor një nxjerr të plotë qelizor nga E. coli që përmban sistemin e rekombinimit λ Red, ku Red beta mund të kryejë rolë të dyfishtë si një proteinë që lidhet me ADN-në dhe si rekombinazë (edhe pse ne e ndaluam në mënyrë të qartë përdorimin e nxjerrjeve qelizore në kërkesën tonë). Në një aplikacion tjetër, Ferrin & Camerini-Otero⁠(hapet në një dritare të re) përdorën vetëm RecA për të kapur në mënyrë selektive molekulat e ADN-së bazuar në sekuenca përputhëse. Veçmas, gp32 është përdorur si një shtesë⁠(hapet në një dritare të re) në një proces të amplifikimit të ADN-së të quajtur PCR për të reduktuar strukturën dytësore. U tregua se amplifikimi NABSA⁠(hapet në një dritare të re) u përmirësua nga të dy RecA dhe gp32, megjithëse secili mund të përmirësonte reaksionin veçmas dhe nuk u identifikua ndonjë sinergji. Më gjerësisht, përmirësimet e raportuara në reaksionet bazë të formimit të ADN-së në stilin Gibson kanë qenë të pakta, me shembullin më të dukshëm që është një proteinë lidhëse e ADN-së e qëndrueshme ndaj nxehtësisë (ET SSB) që rrit efikasitetin e formimit me rreth 2,5 herë⁠(hapet në një dritare të re). 

Për shumicën e zbatimeve, nuk presim që RAPF-HiFi të konkurrojë me thjeshtësinë dhe qëndrueshmërinë e klonimit HiFi/Gibson. Megjithatë, shfaqja e një rruge formimi mekanikisht të veçantë është e rëndësishme: GPT‑5 arriti në një zgjidhje që përfshin një kombinim të panjohur të proteinave të rikombinimit dhe dinamikës së reaksionit. Mekanizmi themelor mund të rezultojë modular, duke ofruar komponentë që mund të ripërdoren ose të rikombinohen në procese të tjera molekulare të punës. Ne gjithashtu po vazhdojmë të eksplorojmë përmirësimet në RAPF-HiFi. Temperaturat e reaksionit dhe kohëzgjatjet e hapave mund të rregullohen për të balancuar aktivitetin e RecA dhe gp32 kundrejt mbidigjestionit nga ekzonukleaza, dhe sasia e të dy proteinave mbetet për t'u optimizuar. GPT‑5 ka propozuar gjithashtu një variant hiperaktiv të RecA, të cilin aktualisht po e purifikojmë.

Në lidhje me protokollin e transformimit, kushtet e optimizimit të suksesshëm përfshinin një gamë aditivësh dhe perturbacionesh termike të destinuara për të përmirësuar efikasitetin e goditjes termike të qelizave komerciale 10-beta kompetente⁠(hapet në një dritare të re). Nga 13 transformimet njëherëshe të përftuara nga AI që u testuan, modifikimi më efikas, Transformimi 7 (T7), peletimi i qelizave, duke hequr gjysmën e vëllimit të dhënë, dhe risuspendimi i qelizave para se të shtohej ADN-ja, të gjitha në 4°C. Qelizat kimikisht kompetente me efikasitet të lartë zakonisht konsiderohen të brishta, dhe hapat e tillë të trajtimit zakonisht shmangen. Megjithatë, qelizat e toleruan mirë përqendrimin. Efektet e kombinuara të ekspozimit të rritur të ADN-së për qelizë dhe tamponit më pak frenues që çon në një goditje më të mprehtë të nxehtësisë çuan në një rritje të konsiderueshme të efikasitetit të transformimit (>30 herë). 

Ky protokoll transformimi është i ri, megjithëse një qasje konceptuale e ngjashme⁠(hapet në një dritare të re) ku qelizat përqendrohen në një hap më të hershëm është raportuar. Veçanërisht, metoda e zhvilluar këtu nga GPT‑5 është e përputhshme me qelizat kimikisht kompetente të gatshme për përdorim, duke shmangur nevojën për përgatitjen e qelizave në laborator, ndërsa tejkalon përfitimet e raportuara të efikasitetit të qasjes së ngjashme në llojet e ngjashme të qelizave.

Për të rritur kapacitetin e përpunimit të këtij sistemi eksperimental model, Robot on Rails dhe Red Queen Bio bashkëpunuan për të ndërtuar një sistem robotik që merr një protokoll klonimi në gjuhë natyrore dhe e ekzekuton atë në laboratorin e lagësht.

Sistemi përbëhet nga tre komponentë: 1) një LLM nga njeriu te roboti që shndërron anglishten e thjeshtë në veprime të robotit; 2) një sistem vizioni që identifikon dhe lokalizon pajisjet laboratorike në kohë reale; dhe 3) një planifikues i rrugës së robotit që përcakton se si të kryhet çdo veprim në mënyrë të sigurt dhe të saktë. Rezultati është një robot laboratorik fleksibël dhe i përgjithësuar, i cili u optimizua më tej për variantet e protokollit të klonimit Gibson.

Ne testuam nëse roboti autonom mund të kryente një eksperiment të plotë klonimi duke ekzekutuar dy protokolle njëkohësisht: metodën standarde HiFi dhe R8, protokollin e modifikuar nga AI që performoi më mirë në raundin e parë të optimizimit.

Ne krahasuam punën e robotit me eksperimentet e kryera nga njerëzit në çdo hap. Roboti e përballoi me sukses procesin e transformimit, i cili kërkonte operacione të ndryshme fizike: transferimin dhe përzierjen e lëngjeve, lëvizjen e epruvetave të mostrave, përdorimin e nxehtësisë së kontrolluar në qeliza dhe shpërndarjen e qelizave në pllaka rritjeje. Kur krahasohet drejtpërdrejt me transformimet e kryera nga njerëzit, roboti përftoi të dhëna me cilësi të ngjashme me përmirësime ekuivalente mbi bazën, duke treguar potencial të hershëm për automatizimin dhe përshpejtimin e optimizimit të eksperimenteve biologjike.

Ndërsa ndryshimet në përmasa midis eksperimenteve me robot dhe ato njerëzore ishin të ngjashme, numërimet absolute të kolonive nga roboti ishin afërsisht dhjetë herë më të ulëta se ekzekutimi manual, duke treguar fusha për përmirësim si precizioni në trajtimin e lëngjeve, kalibrimi i kontrollit të temperaturës dhe riprodhimi i nuancave të teknikave manuale të trajtimit të qelizave.

Ne besojmë se këto eksperimente ofrojnë një pamje çasti të asaj se si do të duket shkenca e përshpejtuar nga AI në të ardhmen: modele që mësojnë vazhdimisht dhe ndërveprojnë me botën reale. Megjithëse eksperimentet tona përjashtuan ndërhyrjen njerëzore për të matur thjesht aftësitë e modelit, ne jemi veçanërisht të emocionuar për AI që vjen në ndihmë të shkencëtarëve⁠ për të hartuar eksperimente dhe kontribuar në arritjet kërkimore.

Ndërsa punojmë për të përshpejtuar përparimin shkencor në mënyrë të sigurt dhe të përgjegjshme, kërkojmë gjithashtu të vlerësojmë dhe të reduktojmë rreziqet, veçanërisht ato që lidhen me biosigurinë. Këto rezultate të vlerësimeve tregojnë se modelet mund të arsyetojnë në laboratorin e lagësht për të përmirësuar protokollet dhe mund të kenë implikime për biosigurinë siç përshkruhet në Kuadrin tonë të gatishmërisë⁠(hapet në një dritare të re). Ne jemi të përkushtuar për të ngritur⁠ masa mbrojtëse të nevojshme dhe të nuancuara në nivel modeli dhe sistemi për të reduktuar këto rreziqe, si dhe për të zhvilluar vlerësime për të ndjekur nivelet aktuale.