De rol van AI bij het versnellen van biologisch laboratoriumonderzoek

Het versnellen van wetenschappelijke vooruitgang is een van de meest waardevolle manieren waarop AI de mensheid kan helpen. Met GPT‑5 zien we daar nu de eerste tekenen⁠ van terug: niet alleen doordat onderzoekers sneller inzicht krijgen in de wetenschappelijke literatuur, maar ook doordat AI nieuwe vormen van wetenschappelijk redeneren ondersteunt. Denk aan het blootleggen van onverwachte verbanden, het voorstellen van bewijsstrategieën en het aandragen van plausibele mechanismen die experts kunnen beoordelen en testen.

Tot nu toe is deze vooruitgang het meest zichtbaar geweest in vakgebieden zoals wiskunde, theoretische natuurkunde en theoretische informatica, waar ideeën rigoureus kunnen worden gecontroleerd zonder fysieke experimenten. Biologie is anders: de meeste vooruitgang is afhankelijk van experimentele uitvoering, iteratie en empirische validatie in laboratoria.

Om te begrijpen hoe grensverleggende modellen zich in deze omgevingen gedragen, hebben we samengewerkt met Red Queen Bio, een biosecurity-start-up, om een evaluatiekader te ontwikkelen dat test hoe een model ideeën voorstelt, analyseert en verfijnt in een laboratoriumomgeving. We hebben een eenvoudig experimenteel systeem voor moleculaire biologie opgezet en GPT‑5 een moleculair kloningsprotocol laten optimaliseren voor efficiëntie.

Tijdens meerdere rondes van experimenten introduceerde GPT‑5 een nieuw mechanisme dat de efficiëntie van klonen met een factor 79 verbeterde. Klonering is een fundamenteel hulpmiddel in de moleculaire biologie. De efficiëntie van kloneringsmethoden is cruciaal voor het opbouwen van grote, complexe biologische bibliotheken die een centrale rol spelen in eiwitengineering⁠(opent in een nieuw venster), genetische screens⁠(opent in een nieuw venster) en stam-engineering van organismen⁠(opent in een nieuw venster). Dit project biedt een kijkje in hoe AI met biologen kan samenwerken om onderzoek te versnellen. Het verbeteren van experimentele methoden zal onderzoekers helpen sneller te werken, kosten te verlagen en ontdekkingen in de praktijk toe te passen.

Omdat vooruitgang in biologisch redeneren gevolgen kan hebben voor de biosecurity, hebben we dit onderzoek uitgevoerd in een streng gecontroleerde omgeving. We gebruikten een onschuldig experimenteel systeem, beperkten de reikwijdte van de taak en evalueerden het gedrag van het model om onze biosecurity-risicobeoordelingen te onderbouwen en passende waarborgen op model- en systeemniveau te ontwikkelen, zoals beschreven in ons Preparedness Framework⁠(opent in een nieuw venster).

In deze opstelling beredeneerde GPT‑5 autonoom over het kloonprotocol, stelde wijzigingen voor en verwerkte gegevens uit nieuwe experimenten om verdere verbeteringen voor te stellen. De enige menselijke interventie was dat wetenschappers het aangepaste protocol uitvoerden en experimentele gegevens uploadden.

In de loop van meerdere rondes optimaliseerde GPT‑5 de kloneringsprocedure, wat resulteerde in een efficiëntieverbetering van meer dan een factor 79. Bij een vaste hoeveelheid input-DNA leverde dit 79 keer meer sequentiegeverifieerde klonen op dan het basisprotocol. Opvallend was dat het twee enzymen introduceerde die samen een nieuw mechanisme vormen: de recombinase RecA uit E. coli en het enkelstrengs DNA-bindende eiwit gp32 van faag T4 (gen 32). In nauwe samenwerking stabiliseert en ontwart gp32 de losse DNA-uiteinden, waarna RecA elke streng naar zijn juiste complement leidt.

Hoewel het nog vroeg is, zijn deze resultaten bemoedigend. De verbeteringen zijn specifiek voor onze bijzondere kloningsopstelling die in ons modelsysteem wordt gebruikt, en vereisen nog steeds dat menselijke wetenschappers de protocollen opzetten en uitvoeren. Toch laten deze experimenten zien dat AI-systemen zinvol kunnen bijdragen aan echt laboratoriumwerk en in de toekomst menselijke wetenschappers kunnen ondersteunen en versnellen.

Opvallend is dat de iteratieve cyclus tussen AI en laboratoriumonderzoek werd uitgevoerd met vaste prompts en zonder menselijke tussenkomst. Deze opzet liet zien dat het model zelfstandig echt nieuwe protocolwijzigingen kan voorstellen, zonder menselijke begeleiding, maar legde het systeem ook vast in een verkennende modus en beperkte daarmee de mogelijkheid om nieuw ontdekte ideeën optimaal door te ontwikkelen. Een betere dynamische balans tussen verkennen en toepassen zou waarschijnlijk tot grotere verbeteringen leiden, aangezien zowel de enzymatische optimalisaties als de verbeteringen in de transformatie nog veel ruimte voor verfijning bieden. We verwachten dat vooruitgang in planning en taakredenering over langere horizons het vermogen van eenvoudige, vaste prompts versterkt om zowel ontdekking als daaropvolgende optimalisatie te ondersteunen.

Sinds de introductie in 2009 geldt de Gibson assembly⁠(opent in een nieuw venster)-reactie als een belangrijke kloneringsmethode binnen de moleculaire biologie. Met Gibson assembly kunnen moleculair biologen stukjes DNA als het ware ‘aan elkaar lijmen’ door de uiteinden kort te verhitten, zodat overeenkomende sequenties samensmelten tot één molecuul. Een belangrijk voordeel van Gibson assembly is de eenvoud: alles gebeurt in één buis bij één temperatuur. Die beperkingen laten van nature ruimte voor verbetering. Bovendien maken de volgende eigenschappen het bijzonder geschikt voor het evalueren van de capaciteit van AI-modellen om laboratoriumtechnieken te verbeteren:

• Goed gedefinieerd met gecontroleerde componenten, in tegenstelling tot een cel-gebaseerd systeem
• Heeft een duidelijke optimalisatiedoelstelling: zoveel mogelijk transformeerbaar, gecirculariseerd DNA verkrijgen uit een vaste hoeveelheid lineair DNA.
• Relatief snelle experimentele cycli (van 1 á 2 dagen)
• Een ontwerpruimte met veel dimensies die mechanistisch redeneren vereist: optimale buffers, reagentia en temperaturen zijn onderling afhankelijk.

We gebruikten HiFi assembly⁠(opent in een nieuw venster), een gepatenteerd enzymsysteem ontwikkeld door New England Biolabs en gebaseerd op Gibson-assembly, als een startpunt voor optimalisatie. We onderzochten of een AI, na het loslaten van de eenstaps- en isotherme beperkingen, kan innoveren en leren van experimentele feedback om tot verbeteringen in het protocol te komen.Concreet voerden we een kloneringsreactie met twee fragmenten uit, met een gen voor groen fluorescerend eiwit (GFP) en het veelgebruikte pUC19-plasmide. Dit plasmide fungeert als standaard DNA-‘drager’ om genen in bacteriën te brengen, zodat ze daar kunnen worden gekopieerd. Het doel was om het aantal succesvolle kolonies te vergroten.

We hebben de kloonreactie geoptimaliseerd door een evolutionair kader te introduceren voor het itereren van voorstellen, waardoor het model 'online' kan leren van zijn eerdere experimenten. In elke ronde stelde GPT‑5 8 tot 10 verschillende reacties voor. Reacties die aangepaste reagentia vereisten die niet direct in het laboratorium beschikbaar waren, werden doorgeschoven naar latere rondes. Wetenschappers voerden vervolgens de reacties uit en maten de kolonietellingen ten opzichte van de basislijn HiFi Gibson-assemby in een eerste screening. De best presterende gegevens uit de vorige ronde werden vervolgens in de volgende ronde verwerkt. Belangrijk is dat de prompting gestandaardiseerd was zonder menselijke invoer, behalve voor verduidelijkende vragen, waardoor we nieuwe mechanistische inzichten direct aan de AI kunnen toeschrijven in plaats van aan menselijke begeleiding. 

We testten de acht best presterende reacties uit de volledige optimalisatieserie opnieuw met een breder bereik aan DNA-verdunningen. Daarbij bleek dat veel reacties kleinere effecten vertoonden dan in de initiële screening. Uiteindelijk kwam een reactie uit ronde 5 naar voren als de sterkste gevalideerde kandidaat, omdat deze de oorspronkelijke prestaties reproduceerde. Veel van de best presterende reacties behoorden tot de ligase-polish-familie, die bijzonder gevoelig lijkt voor kleine variaties in de toestand van competente cellen en voor de verwerking van DNA na de reactie. Omdat deze reacties gebruikmaken van een korte HiFi-stap, veronderstellen we dat veel producten waarschijnlijk E. coli binnendringen met slechts één verzegelde verbinding, terwijl de andere door annealing bijeen wordt gehouden. De verdere afwerking wordt dan overgelaten aan cellulaire DNA-reparatiemechanismen. Dit leidt tot een hoge mate van variatie en een ‘jackpot’-dynamiek: zelfs als varianten van deze reactie meestal niet beter presteren, kan één sterke uitschieter de hele familie meenemen naar volgende rondes. 

Gezien de mechanistische complexiteit optimaliseerden we de kloningsreactie over meerdere rondes. Tegelijkertijd optimaliseerden we de transformatieprocedure in één enkele ‘one-shot’-ronde, waarin het model veel onafhankelijke wijzigingen voorstelde en de best presterende reactie werd geselecteerd.

Met gestandaardiseerde prompts en zonder menselijke tussenkomst verhoogde GPT‑5 de end-to-end efficiëntie van het kloneringsproces met een factor 79, consistent bevestigd over meerdere experimentele herhalingen.

Opvallend is dat het model een nieuwe enzymatische procedure voorstelde, die het de naam RecA-Assisted Pair-and-Finish HiFi Assembly (RAPF-HiFi) gaf. Deze procedure voegt twee nieuwe eiwitten toe aan de reactie: de recombinase RecA uit E. coli en het enkelstrengs DNA-bindende eiwit gp32 van faag T4 (gen 32). Verder maakte het model opzettelijke aanpassingen aan de incubatietemperatuur en -tijd, en de timing van enzymatische toevoegingen: het stelde voor om RecA en gp32 toe te voegen na een initiële HiFi-reactie op 50°C, deze eiwitten te laten werken bij 37°C, en vervolgens terug te keren naar 50°C om de assemblage te voltooien. Samen zorgden deze nieuwe wijzigingen voor een meer dan 2,5-voudige toename van de efficiëntie. Het moet worden opgemerkt dat dit de initiële prestaties vertegenwoordigt zonder iteratieve optimalisatie van de reactieomstandigheden en timing.

Bij de transformatie bleek de meest effectieve aanpassing onverwacht eenvoudig: de cellen pelleteren, de helft van het volume verwijderen en de cellen opnieuw opsuspenderen vóór toevoeging van DNA, alles bij 4 °C. Hoewel chemisch competente cellen met hoge efficiëntie doorgaans als fragiel worden beschouwd, tolereerden de cellen de concentratie goed en verhoogden de toegenomen moleculaire botsingen de transformatie-efficiëntie aanzienlijk (>30-voudig bij de laatste validatie). 

Gibson assembly werkt doordat DNA-fragmenten complementaire ‘kleverige’ uiteinden krijgen, waardoor ze elkaar kunnen vinden en samenvoegen. De reactie maakt gebruik van twee verschillende enzymen, een polymerase en een ligase, om de samengevoegde fragmenten definitief te verbinden. In RAPF-HiFi zijn twee extra eiwitten geïntroduceerd om de matching-stap te verbeteren. Het eerste, gp32, werkt als een soort kam die de losse DNA-uiteinden stabiliseert en ontwart. Het tweede, RecA, fungeert als een gids die voor elke streng de juiste complementaire partner vindt en de bijpassende fragmenten samenbrengt. Bij een hogere temperatuur laten beide hulpeiwitten los van het DNA, waardoor de gebruikelijke Gibson-enzymen de reactie kunnen voltooien.

Samenvattend veronderstellen we dat de verbeterde prestaties tot stand komen via het volgende mechanisme:

• Gp32 bindt aan niet-geannealde enkelstrengs DNA-uiteinden (ssDNA) en voorkomt de vorming van secundaire structuren.
• RecA, dat normaal wordt geremd door secundaire structuren, bindt vanaf het 3’-uiteinde en verdringt daarbij het gp32-filament.
• RecA faciliteert een ssDNA:ssDNA-homologiezoektocht⁠(opent in een nieuw venster) en stimuleert daarmee het annealen.
• Een terugkeer naar 50°C verdringt zowel de recA- als de gp32-filamenten, waardoor polymerase en ligase de reactie kunnen voltooien.

Om te testen of de nieuwe enzymen functioneel waren en om uit te sluiten dat de prestatieverbetering uitsluitend wordt veroorzaakt door veranderingen in thermische stappen of buffers, hebben we de prestaties van RAPF-HiFi getest zonder RecA en zonder zowel RecA als gp32. De prestaties van beide reacties waren verminderd ten opzichte van RAPF-HiFi, wat suggereert dat beide eiwitten noodzakelijk zijn voor het mechanisme van handeling van RAPF-HiFi.

De ontwikkeling van RAPF-HiFi suggereert dat GPT‑5 in staat is tot complex, multidimensionaal redeneren:

• RecA wordt geremd door de DNA-structuur⁠(opent in een nieuw venster), en het is opmerkelijk dat het model twee synergetische aanpassingen tegelijk introduceerde: voeg RecA toe en vul het aan met gp32 om de secundaire DNA-structuur te verwijderen.
• De natuurlijke partner van E. coli-RecA is het enkelstrengs DNA-bindende eiwit (SSB) van E. coli. SSB vervult een vergelijkbare rol als gp32 tijdens genoomreplicatie, recombinatie en reparatie. E. coli-SSB laat echter niet snel genoeg vanzelf los van het DNA om de groei van een RecA-filament mogelijk te maken. In vivo bevordert het RecFOR-complex de nucleatie van RecA aan het SSB-filament⁠(opent in een nieuw venster). SSB bindt als een stabiel tetramer met extreem langzame dissociatiesnelheden⁠(opent in een nieuw venster). Daarentegen is het gp32-filament dynamischer⁠(opent in een nieuw venster), waardoor RecA het kan verdringen. 

Voor zover wij weten, zijn RecA en gp32 niet functioneel samen gebruikt in methoden van de moleculaire biologie. Zoals bij veel nieuwe technieken in de moleculaire biologie waren de onderliggende biochemische activiteiten al bestudeerd, maar ligt de vernieuwing in het gebruik ervan als een praktische, generaliseerbare methode.

Zo is de interactie tussen RecA en gp32 onderzocht in mechanistische in-vitro-reconstitutie-assays. In studies naar D-lusvorming werd aangetoond dat⁠(opent in een nieuw venster) gp32 in staat is de activiteit van RecA te versterken. Gp32 is daarnaast gebruikt in combinatie met zijn natuurlijke T4-recombinasepartner UvsX en de recombinase-laadfactor uvsY in recombinase polymerase amplification (RPA)⁠(opent in een nieuw venster). Hoewel een RPA-octrooiaanvraag stelt⁠(opent in een nieuw venster) dat effectieve RPA-reacties zijn aangetoond met behulp van E. coli-RecA in een heteroloog systeem met een gecompromitteerd (dat wil zeggen ontworpen, niet-wildtype) gp32-eiwit, wordt deze bewering slechts zijdelings genoemd in enkele octrooibeschrijvingen en is zij, voor zover ons bekend, niet onderbouwd door gepubliceerde gegevens of overgenomen als een robuust, op RecA gebaseerd RPA-systeem. Een kloningsmethode genaamd SLiCE⁠(opent in een nieuw venster) maakt gebruik van een volledig celextract van E. coli dat het λ-Red-recombinatiesysteem bevat, waarbij Red beta mogelijk een dubbele rol vervult als zowel DNA-bindend eiwit als recombinase (hoewel we het gebruik van celextracten expliciet hebben uitgesloten in onze prompt). In een andere toepassing gebruikten Ferrin en Camerini-Otero⁠(opent in een nieuw venster) uitsluitend RecA om DNA-moleculen selectief te binden op basis van overeenkomende sequenties. Afzonderlijk is gp32 gebruikt als additief⁠(opent in een nieuw venster) in een DNA-amplificatieproces zoals PCR om secundaire structuren te verminderen. Van NASBA-amplificatie werd aangetoond⁠(opent in een nieuw venster) dat deze wordt versterkt door zowel RecA als gp32, hoewel elk de reactie ook afzonderlijk kan versterken en er geen synergie werd waargenomen. Meer in het algemeen zijn gerapporteerde verbeteringen aan de basisreacties van Gibson-achtige DNA-assemblage schaars, met als meest opvallende voorbeeld een hittebestendig DNA-bindend eiwit (ET SSB) dat de assemblage-efficiëntie met ongeveer een factor 2,5 verbetert⁠(opent in een nieuw venster).

Voor de meeste toepassingen verwachten we niet dat RAPF-HiFi kan concurreren met de eenvoud en robuustheid van HiFi/Gibson-klonering. Het ontstaan van een mechanistisch afwijkende assemblageroute is echter opmerkelijk: GPT‑5 kwam tot een oplossing die een ongebruikelijke combinatie van recombinatie-eiwitten en reactiedynamiek samenbrengt. Het onderliggende mechanisme kan modulair blijken te zijn, waarbij componenten kunnen worden hergebruikt of opnieuw gecombineerd in andere moleculaire workflows. We blijven ook doorgaan met het verkennen van verbeteringen aan RAPF-HiFi. Reactietemperaturen en stapduren kunnen worden afgestemd om de activiteit van RecA en gp32 in balans te brengen tegen overmatige exonuclease-vertering, en de hoeveelheden van beide eiwitten moeten nog worden geoptimaliseerd. GPT‑5 heeft bovendien een hyperactieve RecA-variant voorgesteld, die momenteel wordt gezuiverd.

Wat betreft het transformatieprotocol omvatten de succesvolle optimalisaties een reeks additieven en thermische variaties, bedoeld om de efficiëntie van de heat-shock te verhogen bij commerciële 10-beta competente cellen⁠(opent in een nieuw venster). Van de 13 door AI gegenereerde one-shot transformaties die werden getest, was de meest effectieve wijziging Transformatie 7 (T7), waarbij de cellen werden gepelleteerd, de helft van het toegevoegde volume werd verwijderd en de cellen werden hersuspendeerd voordat DNA werd toegevoegd, allemaal bij 4°C. Hoog-efficiënte chemisch competente cellen worden doorgaans als fragiel beschouwd, en dergelijke handelingen worden meestal vermeden. Niettemin verdroegen de cellen de concentratie goed. De gecombineerde effecten van verhoogde DNA-blootstelling per cel en minder remmende buffer, die leidden tot een scherpere hitte-shock, resulteerden in een aanzienlijke toename van de transformatie-efficiëntie (meer dan 30-voudig). 

Dit transformatieprotocol is nieuw, hoewel eerder een conceptueel vergelijkbare benadering⁠(opent in een nieuw venster) is beschreven waarbij cellen in een vroegere stap worden geconcentreerd. Opvallend is dat de hier door GPT‑5 ontwikkelde methode compatibel is met kant-en-klare chemisch competente cellen, waardoor voorbereiding van cellen in eigen beheer niet nodig is, en dat zij bovendien de gerapporteerde efficiëntieverbeteringen van vergelijkbare benaderingen op vergelijkbare celstammen overtreft.

Om de doorvoer van dit experimentele modelsysteem te verhogen, werkten Robot on Rails en Red Queen Bio samen aan de bouw van een robotsysteem dat een in natuurlijke taal beschreven kloneringsprotocol ontvangt en dit in het lab uitvoert.

Het systeem combineert drie componenten: 1) een LLM die instructies van mens naar robot vertaalt door gewone Engelstalige instructies om te zetten in robotacties; 2) een visiesysteem dat laboratoriumapparatuur in realtime identificeert en lokaliseert; en 3) een padplanningssysteem voor de robot dat bepaalt hoe elke handeling veilig en nauwkeurig wordt uitgevoerd. Het resultaat is een flexibele, algemene laboratoriumrobot die verder is geoptimaliseerd voor varianten van het Gibson-kloningsprotocol.

We testten of de autonome robot een volledig kloneringsexperiment kon uitvoeren door twee protocollen parallel te draaien: de standaard HiFi-methode en R8, het best presterende door AI aangepaste protocol uit de eerste optimalisatieronde.We vergeleken bij elke stap het werk van de robot met experimenten die door mensen zijn uitgevoerd. De robot heeft het transformatieproces succesvol afgehandeld, wat diverse fysieke handelingen vereiste: vloeistoffen overdragen en mengen, monsterbuizen verplaatsen, cellen gecontroleerd verwarmen en cellen op groeiplaten uitspreiden. Wanneer direct vergeleken met door mensen uitgevoerde transformaties, genereerde de robot gegevens van vergelijkbare kwaliteit met gelijkwaardige verbeteringen ten opzichte van de basislijn, wat een vroeg potentieel toont voor het automatiseren en versnellen van de optimalisatie van biologische experimenten.

Hoewel de relatieve factorveranderingen tussen de robot- en handmatige experimenten vergelijkbaar waren, lagen de absolute kolonietellingen bij de robot ongeveer een factor tien lager dan bij handmatige uitvoering. Dit wijst op verbeterpunten, zoals de precisie van vloeistofverwerking, de kalibratie van temperatuurregeling en het reproduceren van de nuances van handmatige celverwerkingstechnieken.

Wij geloven dat deze experimenten een momentopname bieden van hoe de toekomst van door AI-versnelde wetenschap eruit zal zien: modellen die voortdurend leren en met de echte wereld interageren. Hoewel onze experimenten menselijke tussenkomst uitsloten om puur de capaciteiten van het model te meten, zijn we bijzonder enthousiast over AI die wetenschappers helpt⁠ bij het ontwerpen van experimenten en het bijdragen aan doorbraken in onderzoek.

Terwijl we werken aan het veilig en verantwoord versnellen van wetenschappelijke vooruitgang, willen we ook risico's evalueren en verminderen, vooral die met betrekking tot biosecurity. Deze evaluatieresultaten laten zien dat modellen in het laboratorium kunnen redeneren om protocollen te verbeteren, en dat dit gevolgen kan hebben voor biosecurity, zoals beschreven in ons Preparedness Framework⁠(opent in een nieuw venster). We zetten ons in voor het ontwikkelen⁠ van noodzakelijke en genuanceerde waarborgen op model- en systeemniveau om deze risico’s te verkleinen, en voor het opzetten van evaluaties om de huidige stand van zaken te monitoren.