Meranie schopnosti AI urýchliť biologický výskum v mokrom laboratóriu

Urýchľovanie vedeckého pokroku je jedným z najcennejších spôsobov, ako môže umelá inteligencia prospievať ľudstvu. Ohľadom tohto začíname s GPT‑5 vidieť prvé náznaky⁠ – nielen v pomoci výskumníkom rýchlejšie prechádzať vedeckou literatúrou, ale aj v podpore nových foriem vedeckého myslenia, ako je odhaľovanie neočakávaných súvislostí, navrhovanie stratégií dôkazov alebo navrhovanie pravdepodobných mechanizmov, ktoré môžu odborníci vyhodnotiť a otestovať.

Doterajší pokrok bol najviditeľnejší v oblastiach ako matematika, teoretická fyzika a teoretická informatika, kde je možné myšlienky dôkladne overiť bez fyzických experimentov. Biológia je odlišná: napredovanie väčšinou závisí od experimentálneho vykonávania, iterácie a empirického overovania v laboratóriu.

Aby sme pochopili, ako sa modely na hranici správajú v týchto prostrediach, spolupracovali sme s  Red Queen Bio – startupom pôsobiacim v oblasti biologickej bezpečnosti – na vytvorení hodnotiaceho rámca, ktorý testuje, ako model navrhuje, analyzuje a iteruje myšlienky v mokrom laboratóriu. Nastavili sme jednoduchý experimentálny systém molekulárnej biológie a nechali sme GPT‑5 optimalizovať protokol molekulárneho klonovania na zvýšenie efektivity.

Počas viacerých kôl experimentovania GPT‑5 zaviedol nový mechanizmus, ktorý 79-krát zlepšil efektivitu klonovania. Klonovanie je základným nástrojom molekulárnej biológie. Efektivita klonovacích metód je kľúčová na vytvorenie veľkých, komplexných knižníc, ktoré sú zásadné pre inžinierstvo proteínov⁠(otvorí sa v novom okne), genetické skríningy⁠(otvorí sa v novom okne) a inžinierstvo kmeňov organizmov⁠(otvorí sa v novom okne). Tento projekt ponúka pohľad na to, ako by AI mohla spolupracovať s biológmi na urýchlení výskumu. Zlepšenie experimentálnych metód pomôže výskumníkom pracovať rýchlejšie, znížiť náklady a premeniť objavy na skutočný dopad.

Pretože napredovanie v biologickom myslení má dopad na biologickú bezpečnosť, vykonali sme túto prácu v prísne kontrolovanom prostredí použitím neškodného experimentálneho systému s obmedzeným rozsahom úlohy a s hodnotením správania modelu s cieľom podporiť naše hodnotenia rizík v oblasti biologickej bezpečnosti a vývoja ochranných opatrení na úrovni modelu a systému, ako je uvedené v našom Rámci pripravenosti⁠(otvorí sa v novom okne).

V tomto nastavení GPT‑5 samostatne uvažoval o  klonovacom protokole, navrhol úpravy a začlenil údaje z nových experimentov na navrhnutie ďalších vylepšení. Jediným zásahom človeka bolo, že vedci uskutočnili upravený protokol a nahrali experimentálne údaje.

Počas viacerých kôl GPT‑5 optimalizoval klonovací postup na zlepšenie efektivity o viac ako 79-násobok, čo znamená, že pre pevne stanovené množstvo Vstupnej DNA sme získali 79-násobne viac sekvenčne overených klonov ako pri základnom protokole. Zaviedol najmä dva enzýmy tvoriace nový mechanizmus: rekombinázu RecA z E. coli a proteín viažúci sa na jednovláknovú DNA génu 32 fág T4 (gp32). Pracujúc v tandeme, gp32 vyhladzuje a rozmotáva voľné konce DNA a RecA potom vedie každý prameň k jeho správnej zhode.

Hoci sú tieto výsledky predbežné, sú povzbudzujúce. Zlepšenia sú špecifické pre naše konkrétne nastavenie klonovania používané v našom modelovom systéme a stále vyžadujú, aby vedci nastavili a vykonali protokoly. Aj tak tieto experimenty ukazujú, že systémy umelej inteligencie môžu významne pomáhať pri skutočnej laboratórnej práci a v budúcnosti môžu urýchliť prácu ľudských vedcov.

Pozoruhodné je, že AI-lab slučka bola spustená s pevne stanovenými príkazmi a bez ľudského zásahu. Táto opora pomohla odhaliť schopnosť modelu navrhovať skutočne nové zmeny protokolu nezávisle od ľudského vedenia, ale zároveň uzamklo systém do fázy skúmania, a obmedzilo jeho schopnosti maximalizovať výkon novo objavených nápadov. Lepšia dynamická rovnováha medzi skúmaním a využívaním by pravdepodobne mala za následok väčšie prínosy, pretože zlepšenia v enzymatických a transformačných procesoch majú značný priestor na zdokonalenie. Očakávame, že pokroky v plánovaní a uvažovaní o horizonte úloh zlepšia schopnosť jednoduchých pevných príkazov na podporu objavovania aj následnej optimalizácie.

Reakcia Gibson assembly⁠(otvorí sa v novom okne) je od svojho vynálezu v roku 2009 hlavným klonovacím spôsobom s rozšíreným používaním v molekulárnej biológii. Gibsonova zostava (protokol) umožňuje molekulárnym biológom „lepiť“ kúsky DNA tým, že krátko roztavia ich konce, aby sa zhodné sekvencie mohli zapečatiť do jednej molekuly. Jednou z hlavných predností Gibsonovej zostavy je jej jednoduchosť: všetko prebieha v jednej skúmavke pri jednej teplote. Tieto obmedzenia prirodzene ponechávajú priestor na zlepšenie. Okrem toho nasledujúce vlastnosti ho robia vhodným na hodnotenie schopností modelov AI zlepšovať techniky laboratórnej praxe:

• Dobré definovanie s riadenými komponentmi, na rozdiel od systému založeného na bunkách
• Má jasnú optimalizačnú funkciu: transformovateľná cirkularizovaná DNA vyrobená z pevného množstva lineárnych vstupov DNA
• Relatívne rýchle experimentálne cykly (1-2 dni)
• Vysokodimenzionálny návrhový priestor, ktorý vyžaduje mechanistické uvažovanie na zlepšenie: optimálne pufre, reagencie a teploty sú všetky navzájom závislé.

Použili sme HiFi assembly⁠(otvorí sa v novom okne), proprietárny enzýmový systém vyvinutý spoločnosťou New England Biolabs a založený na Gibsonovej zostave, ako východiskový bod pre optimalizáciu. Preskúmali sme, či by umelá inteligencia mohla inovovať a učiť sa z experimentálnych pripomienok po odstránení obmedzení jedného kroku a izotermických podmienok, a tým identifikovať zlepšenia protokolu v tomto scenári.

Konkrétne sme vykonali dvojdielnu klonovaciu reakciu s použitím génu pre zelený fluorescenčný proteín (GFP) a široko používaného plazmidu pUC19, štandardného DNA „nosiča“ používaného na prenos génov do baktérií, aby sa mohli kopírovať. Cieľom bolo zvýšiť počet úspešných kolónií.

Optimalizovali sme klonovaciu reakciu zavedením evolučného rámca na iteráciu návrhov, čo umožňuje modelu učiť sa „online“ zo svojich predchádzajúcich experimentov. V každom kole GPT‑5 navrhol sériu 8-10 rôznych reakcií, pričom reakcie, ktoré vyžadovali špeciálne reagencie, ktoré laboratórium nemalo okamžite k dispozícii, boli presunuté do neskorších kôl. Ľudskí vedci potom uskutočnili reakcie a merali počty kolónií vzhľadom na základnú HiFi Gibson zostavu v úvodnom skríningu. Najlepšie výkonné údaje z predchádzajúceho kola boli potom vložené do ďalej kola. Dôležité je, že podnety boli štandardizované bez ľudského vstupu okrem objasňujúcich otázok, čo nám umožňuje pripísať nové mechanistické vhľady priamo AI, a nie ľudskému vedeniu. 

Znovu sme otestovali osem najlepších reakcií z celej série optimalizácií pomocou širšieho rozsahu riedení DNA a zistili sme, že mnohé z nich vykazovali menšie účinky ako v počiatočnom skríningu; nakoniec najsilnejším overeným kandidátom bola reakcia z piateho kola, ktorá zopakovala svoj pôvodný výkon. Mnoho vysoko výkonných jedincov patrilo do metód využívajúcich ligázu a úpravu koncov (tzv. ligase-polish), ktorá sa javí ako obzvlášť citlivá na malé variácie v stave kompetentných buniek a/alebo v manipulácii s DNA po reakcii. Pretože tieto reakcie použili krátky krok HiFi, predpokladáme, že mnohé produkty pravdepodobne vstupujú do E. coli s iba jedným zapečateným spojom a druhým držiacim sa pomocou annealingu, pričom „downstream“ záchranu nechávajú na bunkové opravné dráhy. To vytvorí vysokú variabilitu a dynamiku „jackpotu“: aj keď väčšina variantov tejto reakcie väčšinou neprekonáva očakávania, jeden silný odľahlý prípad môže posunúť celú skupinu do ďalších kôl. 

Zatiaľ čo sme sa sústredili na optimalizáciu klonovacej reakcie počas viacerých kôl kvôli jej mechanickej zložitosti, paralelne sme optimalizovali transformačný postup pomocou jedného „jednorazového“ kola, kde model navrhol mnoho nezávislých zmien a my sme vybrali najlepšie fungujúcu reakciu.

Použitím štandardizovaných príkazov bez ľudského vstupu GPT5 zlepšil efektivitu end-to-end klonovania 79-násobne, čo bolo potvrdené v experimentálnych replikátoch.

Model najmä navrhol nový enzymatický postup, ktorý nazval RecA-Assisted Pair-and-Finish HiFi Assembly (RAPF-HiFi), pridávajúci do reakcie dva nové proteíny: rekombinázu RecA z E. coli a fágový T4 gén 32 proteín viažuci sa na jednovláknovú DNA (gp32). Ďalej, model vykonal zámerné úpravy inkubačnej teploty a času, ako aj načasovania enzymatických prídavkov: navrhol pridať RecA a gp32 po počiatočnej HiFi reakcii pri 50 °C, nechať tieto proteíny pracovať pri 37 °C a potom sa vrátiť späť na 50 °C na dokončenie montáže. Spoločne tieto nové úpravy zvýšili efektivitu viac ako 2,5-násobne. Treba poznamenať, že toto predstavuje počiatočný výkon bez iteratívnej optimalizácie reakčných podmienok a načasovania.

Na strane transformácie sa ukázalo, že najúčinnejšia úprava bola neočakávane jednoduchá: peletovanie buniek (odstreďovanie, aby sa zhromaždili na dne skúmavky), odstrániť polovicu dodaného objemu a opätovné suspendovanie buniek pred pridaním DNA, všetko pri teplote 4 °C. Hoci sa vysoko účinné chemicky kompetentné bunky zvyčajne považujú za krehké, bunky dobre tolerovali koncentráciu a zvýšené molekulárne zrážky výrazne zvýšili účinnosť transformácie (viac ako 30-násobne pri konečnej validácii). 

Gibsonova zostava funguje tak, že kúskom DNA poskytne zodpovedajúce „lepkavé“ konce, aby sa mohli nájsť a spojiť. Reakcia používa dva rôzne enzýmy (polymerázu a ligázu) na utesnenie spojených častí. V RAPF-HiFi boli zavedené dva proteíny, aby sa zlepšil krok zladenia. Prvý, gp32, pôsobí ako hrebeň, ktorý uhladzuje a rozpletá voľné konce DNA. Druhý, RecA, pôsobí ako sprievodca, ktorý hľadá správneho partnera pre každý prameň a spája zodpovedajúce časti. Vyššia teplota spôsobí, že obaja pomocníci sa oddelia od DNA, čo umožní bežným Gibsonovým enzýmom dokončiť reakciu.

V súhrne predpokladáme, že zlepšenie výkonnosti je sprostredkované nasledujúcim mechanizmom:

• Gp32 pokrýva nežíhané jednovláknové DNA (ssDNA) chvosty, čím odstráni sekundárnu štruktúru
• RecA, normálne inhibovaný štruktúrou, vniká z 3' konca a vytláča gp32 filament
• RecA sprostredkuje hľadanie homológie ssDNA:ssDNA⁠(otvorí sa v novom okne), čím podporuje spájanie
• Návrat na 50 °C vytláča oba filamenty recA a gp32, čo umožňuje polymeráze a ligáze dokončiť reakciu.

Aby sme otestovali, či sú nové enzýmy funkčné, a aby sme vylúčili, že zlepšenie výkonu je spôsobené výlučne zmenami v tepelných krokoch alebo pufroch, testovali sme výkon RAPF-HiFi bez RecA a bez oboch, RecA aj gp32. Výkon oboch reakcií bol znížený v porovnaní s RAPF-HiFi, čo naznačuje, že obe bielkoviny sú nevyhnutné pre mechanizmus akcie RAPF-HiFi.

Vývoj RAPF-HiFi naznačuje, že GPT‑5 je schopný komplexného, viacrozmerného myslenia:

• RecA je inhibovaný štruktúrou DNA⁠(otvorí sa v novom okne), a je pozoruhodné, že model zaviedol dve synergické modifikácie naraz: pridať RecA a doplniť ho gp32 na odstránenie sekundárnej štruktúry DNA.
• Prirodzeným partnerom E. coli RecA je E. coli proteín viažuci sa na jednovláknovú DNA (SSB). SSB zohráva podobnú rolu ako gp32 počas replikácie, rekombinácie a opravy genómu. Avšak, E. coli SSB sa spontánne neodpojí od DNA dostatočne rýchlo na rast vlákna RecA, pričom komplex RecFOR podporuje nukleáciu RecA na vlákne SSB in vivo⁠(otvorí sa v novom okne). SSB sa viaže ako stabilný tetramér s extrémne pomalými rýchlosťami disociácie⁠(otvorí sa v novom okne). Naopak, vlákno gp32 je dynamickejšie⁠(otvorí sa v novom okne), čo umožňuje vytláčanie RecA. 

Podľa našich znalostí neboli RecA a gp32 spoločne funkčne použité v metódach molekulárnej biológie. Podobne ako pri mnohých nových technikách molekulárnej biológie, základné biochemické aktivity už boli preskúmané, ale ich využitie ako praktickej, všeobecne použiteľnej metódy predstavuje pokrok.

Napríklad, interakcia medzi RecA a gp32 bola skúmaná v mechanistických in vitro rekonštitučných testoch: v štúdiách tvorby D slučky sa ukázalo, že gp32⁠(otvorí sa v novom okne) je schopný zvyšovať aktivitu RecA. Gp32 sa používa v spojení so svojím prirodzeným partnerom T4 rekombinázou UvsX a faktorom na naloženie rekombinázy uvsY v rekombinázovej polymerázovej amplifikácii (RPA⁠(otvorí sa v novom okne)). Hoci špecifikácia patentu RPA uvádza⁠(otvorí sa v novom okne), že účinné reakcie RPA boli demonštrované pomocou E. coli RecA v heterológnom systéme s kompromitovaným (t. j. inžiniersky upraveným, nie divokým typom) proteínom gp32, toto tvrdenie sa objavuje len ako okrajová poznámka v niektorých patentových zverejneniach a podľa našich znalostí nebolo podporené publikovanými údajmi ani prijaté ako robustný systém RPA založený na RecA. Jedna metóda klonovania nazývaná SLiCE⁠(otvorí sa v novom okne) používa celý bunkový extrakt z E. coli obsahujúci rekombinačný systém λ Red, kde Red beta môže plniť dvojitú rolu ako proteín viažuci DNA a rekombináza (aj keď sme v našom príkaze výslovne zakázali použitie bunkových extraktov). V inej aplikácii Ferrin & Camerini-Otero⁠(otvorí sa v novom okne) použili samotný RecA na selektívne zachytenie molekúl DNA na základe zhodných sekvencií. Samostatne, gp32 bol použitý ako prísada⁠(otvorí sa v novom okne) v procese amplifikácie DNA nazývanom PCR na zníženie sekundárnej štruktúry. Bolo preukázané, že amplifikácia NABSA⁠(otvorí sa v novom okne) bola zlepšená oboma, RecA aj gp32, hoci každý z nich mohol reakciu zlepšiť samostatne a žiadna synergia nebola identifikovaná. Vo všeobecnosti boli hlásené zlepšenia základných reakcií na zostavovanie DNA v štýle Gibson zriedkavé, pričom najvýznamnejším príkladom je tepelne stabilný proteín viažuci DNA (ET SSB), ktorý zvyšuje účinnosť zostavovania približne 2,5-násobne⁠(otvorí sa v novom okne). 

Pre väčšinu aplikácií neočakávame, že RAPF-HiFi bude konkurovať jednoduchosti a robustnosti klonovania HiFi/Gibson. Avšak, objavenie mechanisticky odlišnej montážnej dráhy je pozoruhodné: GPT‑5 prišiel s riešením, ktoré zahŕňa neznámu kombináciu rekombinačných proteínov a dynamiky reakcií. Základný mechanizmus môže byť modulárny, poskytujúc komponenty, ktoré je možné znovu použiť alebo kombinovať v iných molekulárnych pracovných postupoch. Pokračujeme aj v skúmaní zlepšení RAPF-HiFi. Teploty reakcií a trvanie krokov možno nastaviť tak, aby sa vyvážila aktivita RecA a gp32 proti nadmernému tráveniu exonukleázou, a množstvá oboch proteínov je ešte potrebné optimalizovať. GPT‑5 tiež navrhol hyperaktívny variant RecA, ktorý momentálne purifikujeme.

Pokiaľ ide o transformačný protokol, úspešné optimalizačné podmienky zahŕňali škálu prísad a tepelných porúch určených na zvýšenie účinnosti tepelného šoku komerčných 10-beta kompetentných buniek⁠(otvorí sa v novom okne). Z 13 AI-generovaných jednorazových transformácií, ktoré boli testované, bola najúčinnejšia modifikácia, Transformácia 7 (T7), ktorá peletizovala bunky, odstránila polovicu dodaného objemu a znovu suspendovala bunky pred pridaním DNA, všetko pri teplote 4 °C. Vysokoúčinné chemicky kompetentné bunky sa zvyčajne považujú za krehké, a preto sa vo všeobecnosti vyhýbajú takýmto manipulačným krokom. Napriek tomu bunky dobre znášali koncentráciu. Kombinované účinky zvýšenej expozície DNA na bunku a zníženého množstva inhibičného pufra, čo vedie k ostrejšiemu tepelnému šoku, viedli k výraznému zvýšeniu účinnosti transformácie (viac ako 30-násobne). 

Tento transformačný protokol je nový, aj keď bol nahlásený konceptuálne podobný prístup⁠(otvorí sa v novom okne), kde sú bunky koncentrované v skoršom kroku. Pozoruhodne, metóda vyvinutá tu GPT‑5 je kompatibilná s bežne dostupnými chemicky kompetentnými bunkami, čím sa eliminuje potreba prípravy buniek v laboratóriu, pričom prevyšuje hlásené zisky efektivity podobného prístupu na porovnateľných bunkových kmeňoch.

Na zvýšenie priepustnosti tohto modelového experimentálneho systému spolupracovali Robot on Rails a Red Queen Bio na vytvorení robotického systému, ktorý prijíma protokol klonovania v prirodzenom jazyku a vykonáva ho v mokrom laboratóriu.

Systém kombinuje tri komponenty: 1) ľudský-robotický LLM, ktorý prevádza jednoduchú angličtinu na akcie robota; 2) vizuálny systém, ktorý v reálnom čase identifikuje a lokalizuje laboratórne vybavenie; a 3) plánovač robotických trás, ktorý určuje, ako vykonať každú akciu bezpečne a presne. Výsledkom je flexibilný, všeobecný laboratórny robot, ktorý bol ďalej optimalizovaný pre varianty Gibsonovho klonovacieho protokolu.

Testovali sme, či autonómny robot dokáže vykonať kompletný klonovací experiment spustením dvoch protokolov súčasne: štandardnej metódy HiFi a R8, najvýkonnejšieho protokolu upraveného umelou inteligenciou z prvého kola optimalizácie.

Porovnali sme prácu robota s experimentmi vykonanými ľuďmi na každom kroku. Robot úspešne zvládol proces transformácie, ktorý vyžadoval rôzne fyzické operácie: prenos a miešanie kvapalín, presúvanie vzoriek v skúmavkách, aplikáciu kontrolovaného tepla na bunky a rozotieranie buniek na rastové platne. Pri priamom porovnaní s transformáciami vykonanými ľuďmi robot generoval dáta podobnej kvality s ekvivalentnými zlepšeniami oproti základnej línii, čo ukazuje skorý potenciál na automatizáciu a urýchlenie optimalizácie biologických experimentov.

Hoci boli zmeny v násobkoch medzi experimentmi s robotom a človekom podobné, absolútne počty kolónií z robota boli približne desaťnásobne nižšie ako pri manuálnom vykonávaní, čo naznačuje oblasti na zlepšenie, ako sú presnosť manipulácie s kvapalinami, kalibrácia regulácie teploty a replikácia nuáns manuálnych techník manipulácie s bunkami.

Sme presvedčení, že tieto experimenty ponúkajú ukážku toho, ako bude vyzerať budúca veda urýchlená umelou inteligenciou: modely, ktoré sa neustále učia a interagujú so skutočným svetom. Hoci naše experimenty vylúčili ľudský zásah, aby sme čisto merali schopnosti modelu, sme obzvlášť nadšení z umelej inteligencie pomáhajúcej ľudským vedcom⁠ navrhovať experimenty a prispievať k prelomom vo výskume.

Keď pracujeme na bezpečnom a zodpovednom urýchľovaní vedeckého pokroku, zároveň sa snažíme hodnotiť a znižovať riziká, najmä tie, ktoré súvisia s biologickou bezpečnosťou. Tieto výsledky hodnotení ukazujú, že modely môžu Mysli v mokrom laboratóriu na zlepšenie protokolov a môžu mať dôsledky pre biologickú bezpečnosť, ako je opísané v našom Rámci pripravenosti⁠(otvorí sa v novom okne). Sme odhodlaní budovať⁠ potrebné a jemne vyladené ochranné opatrenia na úrovni modelu a systému, aby sme znížili tieto riziká, a tiež vyvíjať hodnotenia na sledovanie aktuálnych úrovní.