DI gebėjimo paspartinti biologinius tyrimus laboratorijoje vertinimas

Mokslo pažangos spartinimas yra vienas vertingiausių būdų, kaip DI gali pasitarnauti žmonijai. Naudodami GPT‑5, pradedame matyti ankstyvuosius to ženklus⁠ – ne tik padedant tyrėjams greičiau analizuoti mokslinę literatūrą, bet ir palaikant naujas mokslinio samprotavimo formas, pavyzdžiui, atskleidžiant netikėtus ryšius, siūlant įrodymo strategijas ar tikėtinus mechanizmus, kuriuos ekspertai gali įvertinti ir išbandyti.

Iki šiol padaryta pažanga geriausiai matoma tokiose srityse kaip matematika, teorinė fizika ir teorinė informatika, kur idėjas galima griežtai patikrinti be fizinių eksperimentų. Biologija yra kitokia: dauguma pasiekimų priklauso nuo eksperimentinio vykdymo, iteracijų ir empirinio patvirtinimo laboratorijoje.

Siekdami suprasti, kaip pažangiausi modeliai elgiasi tokioje aplinkoje, bendradarbiaudami su biologinio saugumo startuoliu „Red Queen Bio“ sukūrėme vertinimo sistemą, tikrinančią, kaip modelis siūlo, analizuoja ir kartoja idėjas laboratorijoje. Parengėme paprastą molekulinės biologijos eksperimentinę sistemą ir paskyrėme GPT‑5 optimizuoti molekulinio klonavimo protokolą siekdami efektyvumo.

Per kelis eksperimentų etapus GPT‑5 įdiegė naują mechanizmą, kuris pagerino klonavimo efektyvumą 79 kartus. Klonavimas yra fundamentalus molekulinės biologijos įrankis. Klonavimo metodų efektyvumas yra labai svarbus kuriant dideles, sudėtingas bibliotekas, kurios yra esminės baltymų inžinerijai⁠(atsidaro naujame lange), genetinėms atrankoms⁠(atsidaro naujame lange) ir organizmų padermių inžinerijai⁠(atsidaro naujame lange). Šis projektas leidžia pažvelgti, kaip DI galėtų dirbti kartu su biologais spartinant tyrimus. Eksperimentinių metodų tobulinimas padės tyrėjams dirbti greičiau, sumažinti sąnaudas ir pritaikyti atradimus realiame pasaulyje.

Kadangi biologinio samprotavimo pažanga turi pasekmių biologiniam saugumui, šį darbą atlikome griežtai kontroliuojamoje aplinkoje – naudojome saugią eksperimentinę sistemą, ribojome užduoties apimtį ir vertinome modelio elgseną, kad gautume informacijos savo biologinio saugumo rizikos vertinimams bei modelio ir sistemos lygmens apsaugos priemonėms kurti, kaip nurodyta mūsų Pasirengimo sistemoje⁠(atsidaro naujame lange).

Šioje sąrankoje GPT‑5 savarankiškai samprotavo apie klonavimo protokolą, siūlė modifikacijas ir įtraukė duomenis iš naujų eksperimentų, kad pasiūlytų daugiau patobulinimų. Vienintelis žmogaus įsikišimas buvo mokslininkų atliekamas modifikuoto protokolo vykdymas ir eksperimentinių duomenų įkėlimas.

Per kelis etapus GPT‑5 optimizavo klonavimo procedūrą, pagerindamas efektyvumą daugiau nei 79 kartus – tai reiškia, kad iš fiksuoto įvesties DNR kiekio gavome 79 kartus daugiau sekos patikrintų klonų nei pagal bazinį protokolą. Svarbiausia tai, kad jis įvedė du fermentus, sudarančius naują mechanizmą: rekombinazę „RecA“ iš E. coli ir fago T4 geno 32 viengrandę DNR prijungiantį baltymą (gp32). Veikdami kartu, gp32 išlygina ir atnarplioja laisvus DNR galus, o tada „RecA“ nukreipia kiekvieną grandinę į jai tinkamą atitikmenį.

Nors rezultatai ankstyvi, jie nuteikia optimistiškai. Patobulinimai yra specifiniai konkrečiai mūsų modelinėje sistemoje naudotai klonavimo sąrankai, o protokolus vis dar turi parengti ir vykdyti mokslininkai. Vis dėlto šie eksperimentai rodo, kad DI sistemos gali reikšmingai padėti realiame laboratoriniame darbe ir ateityje paspartinti mokslininkų veiklą.

Pažymėtina, kad DI ir laboratorijos ciklas vyko naudojant fiksuotas užklausas ir be žmogaus įsikišimo. Ši struktūra padėjo atskleisti modelio gebėjimą siūlyti išties naujus protokolo pakeitimus nepriklausomai nuo žmogaus nurodymų, tačiau ji taip pat įkalino sistemą tyrinėjimo režime ir apribojo jos galimybes maksimaliai padidinti naujai atrastų idėjų našumą. Geresnė dinaminė pusiausvyra tarp tyrinėjimo ir panaudojimo greičiausiai duotų didesnį prieaugį, nes tiek fermentiniai, tiek transformacijos patobulinimai turi daug erdvės tobulėjimui. Tikimės, kad planavimo ir užduočių numatymo samprotavimo pažanga pagerins paprastų fiksuotų užklausų gebėjimą palaikyti tiek atradimus, tiek vėlesnį optimizavimą.

„Gibson“ surinkimo⁠(atsidaro naujame lange) reakcija buvo pagrindinis klonavimo metodas nuo jos išradimo 2009 m. ir plačiai taikoma molekulinėje biologijoje. „Gibson“ surinkimas leidžia molekulinės biologijos specialistams „suklijuoti“ DNR dalis, trumpam išlydant jų galus, kad atitinkančios sekos galėtų susijungti į vieną molekulę. Vienas pagrindinių „Gibson“ surinkimo privalumų yra paprastumas: viskas vyksta viename mėgintuvėlyje esant vienai temperatūrai. Šie apribojimai natūraliai palieka erdvės tobulėjimui. Be to, dėl toliau nurodytų savybių jis puikiai tinka vertinti DI modelių gebėjimus tobulinti laboratorinius metodus:

• aiškiai apibrėžtas su kontroliuojamais komponentais, skirtingai nei ląstelių sistema;
• turi aiškią optimizavimo funkciją: transformuojama žiedinė DNR, pagaminta iš fiksuoto kiekio linijinių DNR įvesčių;
• santykinai greiti eksperimentiniai ciklai (1–2 dienos);
• daugiadimensė projektavimo erdvė, kuriai tobulinti reikia mechanistinio samprotavimo: optimalūs buferiai, reagentai ir temperatūros yra tarpusavyje susiję.

Optimizavimo pradžiai naudojome „HiFi“ surinkimą⁠(atsidaro naujame lange) – patentuotą fermentų sistemą, sukurtą „New England Biolabs“ ir pagrįstą „Gibson“ surinkimu. Tyrėme, ar DI galėtų diegti naujoves ir mokytis iš eksperimentinio grįžtamojo ryšio pašalinus vieno žingsnio ir izoterminius apribojimus, ir taip nustatyti protokolo patobulinimus šiame scenarijuje.

Konkrečiai, atlikome dviejų dalių klonavimo reakciją naudodami žalio fluorescuojančio baltymo (GFP) geną ir plačiai naudojamą plazmidę pUC19 – standartinę DNR „transporto priemonę“, naudojamą genams įnešti į bakterijas, kad jas būtų galima kopijuoti. Tikslas buvo padidinti sėkmingų kolonijų skaičių.

Klonavimo reakciją optimizavome įdiegę evoliucinę sistemą pasiūlymams kartoti, leidžiančią modeliui mokytis eigoje iš savo ankstesnių eksperimentų. Kiekviename etape GPT‑5 pasiūlydavo 8–10 skirtingų reakcijų partiją, o reakcijos būdavo perkeliamos į vėlesnius etapus, jei joms reikėdavo specialių reagentų, kurių laboratorija neturėjo po ranka. Tuomet mokslininkai atlikdavo reakcijas ir matuodavo kolonijų skaičių, lygindami jį su baziniu „HiFi Gibson“ surinkimu pirminėje atrankoje. Geriausi praėjusio etapo duomenys būdavo perduodami į kitą etapą. Svarbu tai, kad raginimai buvo standartizuoti, be jokio žmogaus indėlio, išskyrus patikslinamuosius klausimus, todėl naujas mechanistines įžvalgas galėjome priskirti tiesiogiai DI, o ne žmogaus nurodymams. 

Iš naujo išbandėme aštuonias geriausias visos optimizavimo serijos reakcijas naudodami platesnį DNR praskiedimų spektrą ir nustatėme, kad daugelio jų poveikis buvo mažesnis nei pirminėje atrankoje; galiausiai stipriausias patvirtintas kandidatas buvo 5-ojo etapo reakcija, kuri pakartojo savo pradinį našumą. Daugelis geriausiai pasirodžiusiųjų priklausė „ligase-polish“ grupei, kuri atrodo ypač jautri mažiems kompetentinių ląstelių būklės ir (arba) DNR tvarkymo po reakcijos pokyčiams. Kadangi šiose reakcijose buvo naudojamas trumpas „HiFi“ žingsnis, keliame hipotezę, kad daugelis produktų į E. coli patenka tik su viena sandaria jungtimi, o kitą laiko hibridizacija, paliekant tolesnį gelbėjimą ląstelių taisymo takams. Tai sukuria didelį variantiškumą ir „aukso puodo“ dinamiką: net jei dažniausiai šios reakcijos variantai nepralenkia kitų, viena stipri išimtis gali perkelti šeimą į kitus etapus. 

Nors dėl mechanistinio sudėtingumo daugiausia dėmesio skyrėme klonavimo reakcijos optimizavimui per kelis etapus, lygiagrečiai optimizavome transformacijos procedūrą naudodami vieną „vienkartinį“ etapą, kuriame modelis pasiūlė daug nepriklausomų pakeitimų, ir atrinkome geriausiai veikusią reakciją.

Naudojant standartizuotus raginimus be žmogaus įsikišimo, GPT‑5 pagerino bendrą klonavimo efektyvumą 79 kartus, o tai patvirtinta eksperimentiniais pakartojimais.

Pažymėtina, kad modelis pasiūlė naują fermentinę procedūrą, kurią pavadino „RecA-Assisted Pair-and-Finish HiFi Assembly“ („RAPF-HiFi“) ir kuri į reakciją įtraukia du naujus baltymus: rekombinazę „RecA“ iš E. coli ir fago T4 geno 32 viengrandę DNR prijungiantį baltymą (gp32). Be to, modelis sąmoningai pakeitė inkubavimo temperatūrą ir laiką bei fermentų pridėjimo laiką: pasiūlė pridėti „RecA“ ir gp32 po pradinės 50 °C „HiFi“ reakcijos, leidžiant šiems baltymams veikti 37 °C temperatūroje, o tada grįžti prie 50 °C surinkimui užbaigti. Kartu šios naujos modifikacijos padidino efektyvumą daugiau nei 2,5 karto. Reikėtų pažymėti, kad tai yra pradinis našumas be iteracinio reakcijos sąlygų ir laiko optimizavimo.

Kalbant apie transformaciją, veiksmingiausia modifikacija pasirodė netikėtai paprasta: ląstelių nusodinimas (jų centrifugavimas, kad susikauptų mėgintuvėlio dugne), pusės tiekiamo tūrio pašalinimas ir ląstelių resuspendavimas prieš pridedant DNR – visa tai 4 °C temperatūroje. Nors didelio efektyvumo chemiškai kompetentinės ląstelės paprastai laikomos trapiomis, jos gerai toleravo koncentraciją, o padidėję molekuliniai susidūrimai iš esmės padidino transformacijos efektyvumą (>30 kartų galutinio patvirtinimo metu). 

„Gibson“ surinkimas veikia suteikiant DNR dalims atitinkamus „lipnius“ galus, kad jos galėtų rasti viena kitą ir susijungti. Reakcijai naudojami du skirtingi fermentai (polimerazė ir ligazė) sujungtoms dalims užsandarinti. „RAPF-HiFi“ atveju buvo įvesti du baltymai, kad atitikimo žingsnis veiktų geriau. Pirmasis, gp32, veikia kaip šukos, kurios išlygina ir išnarplioja laisvus DNR galus. Antrasis, „RecA“, veikia kaip vedlys, ieškantis tinkamo partnerio kiekvienai grandinei ir sutraukiantis atitinkamas dalis. Dėl aukštesnės temperatūros abu pagalbininkai atsiskiria nuo DNR, leisdami įprastiems „Gibson“ fermentams užbaigti reakciją.

Apibendrinant galima teigti, kad geresnis veikimas pasiekiamas per šį mechanizmą:

• Gp32 padengia nehibridizuotas viengrandės DNR (vgDNR) uodegas, pašalindamas antrinę struktūrą;
• „RecA“, paprastai slopinamas struktūros, įsiskverbia nuo 3’ galo ir išstumia gp32 giją;
• „RecA“ tarpininkauja vgDNR:vgDNR homologijos paieškoje⁠(atsidaro naujame lange), skatindamas hibridizaciją
• Grįžimas prie 50 °C išstumia tiek „RecA“, tiek gp32 gijas, leisdamas polimerazei ir ligazei užbaigti reakciją.

Norėdami patikrinti, ar nauji fermentai veikia, ir atmesti galimybę, kad našumas pagerėjo tik dėl terminių žingsnių ar buferių pakeitimų, išbandėme „RAPF-HiFi“ veikimą be „RecA“ ir be abiejų – „RecA“ ir gp32. Abiejų reakcijų našumas sumažėjo, palyginti su „RAPF-HiFi“, o tai rodo, kad abu baltymai yra būtini „RAPF-HiFi“ veikimo mechanizmui.

„RAPF-HiFi“ sukūrimas rodo, kad GPT‑5 geba atlikti sudėtingą, daugiadimensį samprotavimą:

• „RecA“ slopina DNR struktūra⁠(atsidaro naujame lange), todėl pastebėtina, kad modelis vienu metu įdiegė dvi sinergines modifikacijas: pridėjo „RecA“ ir papildė jį gp32 DNR antrinei struktūrai pašalinti.
• Natūralus E. coli „RecA“ partneris yra E. coli viengrandę DNR prijungiantis baltymas (SSB). SSB atlieka panašų vaidmenį kaip gp32 genomo replikacijos, rekombinacijos ir taisymo metu. Tačiau E. coli SSB savaime neatsiskiria nuo DNR pakankamai greitai, kad augtų „RecA“ gija, o kompleksas „RecFOR“ skatina „RecA“ branduolių susidarymą ant SSB gijos in vivo⁠(atsidaro naujame lange). SSB jungiasi kaip stabilus tetrameras su itin lėtu atsiskyrimo greičiu⁠(atsidaro naujame lange). Priešingai, gp32 gija yra dinamiškesnė⁠(atsidaro naujame lange), leidžianti „RecA“ išstūmimą. 

Mūsų žiniomis, „RecA“ ir gp32 nebuvo funkciškai kartu naudojami molekulinės biologijos metoduose. Kaip ir daugelio naujų molekulinės biologijos metodų atveju, pagrindinė biocheminė veikla jau buvo ištirta, tačiau pažanga laikomas jų panaudojimas praktiškame, apibendrinamame metode.

Pavyzdžiui, „RecA“ ir gp32 sąveika buvo tirta mechanistiniuose in vitro atkūrimo tyrimuose: D kilpos susidarymo tyrimuose buvo parodyta, kad gp32⁠(atsidaro naujame lange) gali sustiprinti „RecA“ aktyvumą. Gp32 buvo naudojamas kartu su natūraliu T4 rekombinazės partneriu UvsX ir rekombinazės įkėlimo faktoriumi uvsY rekombinazės polimerazės amplifikacijoje (RPA)⁠(atsidaro naujame lange). Nors RPA patento specifikacijoje teigiama⁠(atsidaro naujame lange), kad veiksmingos RPA reakcijos buvo pademonstruotos naudojant E. coli „RecA“ heterologinėje sistemoje su pažeistu (t. y. inžineriniu būdu pakeistu, ne laukinio tipo) gp32 baltymu, šis teiginys pasirodo tik kaip šalutinė pastaba kai kuriuose patentų atskleidimuose ir, mūsų žiniomis, nebuvo pagrįstas paskelbtais duomenimis ar priimtas kaip patikima „RecA“ pagrįsta RPA sistema. Vienas klonavimo metodas, vadinamas SLiCE⁠(atsidaro naujame lange), naudoja viso ląstelės ekstrakto iš E. coli su λ Red rekombinacijos sistema, kur „Red beta“ gali atlikti dvejopą vaidmenį – ir kaip DNR prijungiantis baltymas, ir kaip rekombinazė (nors savo užklausoje aiškiai uždraudėme naudoti ląstelių ekstraktus). Kitoje taikymo srityje Ferrin ir Camerini-Otero⁠(atsidaro naujame lange) naudojo tik „RecA“, kad selektyviai sugautų DNR molekules pagal atitinkančias sekas. Atskirai gp32 buvo naudojamas kaip priedas⁠(atsidaro naujame lange) DNR amplifikacijos procese, vadinamame PGR, siekiant sumažinti antrinę struktūrą. Buvo parodyta, kad NABSA amplifikaciją⁠(atsidaro naujame lange) sustiprina tiek „RecA“, tiek gp32, nors kiekvienas iš jų galėjo sustiprinti reakciją atskirai ir sinergijos nenustatyta. Plačiau žiūrint, pranešimų apie bazinių „Gibson“ stiliaus DNR surinkimo reakcijų patobulinimus buvo nedaug, o ryškiausias pavyzdys yra karščiui atsparus DNR prijungiantis baltymas (ET SSB), kuris pagerina surinkimo efektyvumą maždaug 2,5 karto⁠(atsidaro naujame lange).

Daugeliu atvejų nesitikime, kad „RAPF-HiFi“ konkuruos su „HiFi“ / „Gibson“ klonavimo paprastumu ir patikimumu. Tačiau mechanistiškai skirtingo surinkimo būdo atsiradimas yra vertas dėmesio: GPT‑5 priėjo prie sprendimo, kuris apima neįprastą rekombinacijos baltymų ir reakcijos dinamikos derinį. Pagrindinis mechanizmas gali būti modulinis, suteikiantis komponentų, kuriuos galima pritaikyti ar derinti kitose molekulinėse darbo eigose. Taip pat toliau tiriame „RAPF-HiFi“ patobulinimus. Reakcijos temperatūros ir žingsnių trukmė gali būti suderinta siekiant subalansuoti „RecA“ ir gp32 aktyvumą su egzonukleazės pertekline skaidymo veikla, o abiejų baltymų kiekiai dar turi būti optimizuoti. GPT‑5 taip pat pasiūlė hiperaktyvų „RecA“ variantą, kurį šiuo metu gryniname.

Kalbant apie transformacijos protokolą, sėkmingos optimizavimo sąlygos apėmė įvairius priedus ir terminius trikdžius, skirtus pagerinti komercinių 10-beta kompetentinių ląstelių⁠(atsidaro naujame lange) šiluminio šoko efektyvumą. Iš 13-os DI sugeneruotų vienkartinių transformacijų, veiksmingiausia modifikacija – Transformacija 7 (T7) – nusodino ląsteles, pašalino pusę tiekiamo tūrio ir resuspendavo ląsteles prieš pridedant DNR, visa tai 4 °C temperatūroje. Didelio efektyvumo chemiškai kompetentinės ląstelės paprastai laikomos trapiomis, todėl tokių tvarkymo veiksmų dažniausiai vengiama. Vis dėlto ląstelės gerai toleravo koncentravimą. Dėl bendro padidėjusios DNR ekspozicijos vienai ląstelei ir mažesnio slopinamojo buferio poveikio, lėmusio staigesnį šiluminį šoką, transformacijos efektyvumas iš esmės padidėjo (>30 kartų). 

Šis transformacijos protokolas yra naujas, nors buvo pranešta apie konceptualiai panašų būdą⁠(atsidaro naujame lange), kai ląstelės koncentruojamos ankstesniame etape. Pažymėtina, kad čia GPT‑5 sukurtas metodas yra suderinamas su komercinėmis chemiškai kompetentinėmis ląstelėmis, todėl nereikia ruošti ląstelių savo jėgomis, kartu viršijant panašaus metodo efektyvumo prieaugį, apie kurį pranešta naudojant panašias ląstelių padermes.

Siekdami padidinti šios modelinės eksperimentinės sistemos pralaidumą, „Robot on Rails“ ir „Red Queen Bio“ bendradarbiaudami sukūrė robotizuotą sistemą, kuri priima klonavimo protokolą natūraliąja kalba ir vykdo jį laboratorijoje.

Sistemą sudaro trys komponentai: 1) žmogaus ir roboto LLM, konvertuojantis paprastą anglų kalbą į roboto veiksmus; 2) regos sistema, realiuoju laiku identifikuojanti laboratorinius indus ir nustatanti jų vietą; ir 3) robotizuota kelio planavimo priemonė, nustatanti, kaip saugiai ir tiksliai atlikti kiekvieną veiksmą. Rezultatas – lankstus, universalus laboratorinis robotas, kuris buvo toliau optimizuojamas „Gibson“ klonavimo protokolo variantams.

Išbandėme, ar autonominis robotas gali atlikti visą klonavimo eksperimentą, vienu metu vykdydami du protokolus: standartinį „HiFi“ metodą ir R8 – geriausiai veikiantį DI modifikuotą protokolą iš pirmojo optimizavimo etapo.

Kiekviename etape lyginome roboto darbą su žmonių atliktais eksperimentais. Robotas sėkmingai atliko transformacijos procesą, kuriam reikėjo įvairių fizinių operacijų: skysčių perkėlimo ir maišymo, mėgintuvėlių perkėlimo, kontroliuojamo ląstelių kaitinimo ir ląstelių pasėjimo ant auginimo lėkštelių. Tiesiogiai palyginus su žmonių atliktomis transformacijomis, robotas sugeneravo panašios kokybės duomenis su lygiaverčiais patobulinimais, palyginti su bazine linija, o tai rodo ankstyvą potencialą automatizuoti ir spartinti biologinių eksperimentų optimizavimą.

Nors pokyčiai kartais tarp roboto ir žmogaus eksperimentų buvo panašūs, absoliutus roboto kolonijų skaičius buvo maždaug dešimt kartų mažesnis nei atliekant rankiniu būdu, o tai rodo tobulintinas sritis, tokias kaip skysčių dozavimo tikslumas, temperatūros valdymo kalibravimas ir rankinio ląstelių tvarkymo technikos niuansų atkartojimas.

Tikime, kad šie eksperimentai suteikia vaizdą, kaip atrodys ateities DI spartinamas mokslas: modeliai nuolat mokysis ir sąveikaus su realiuoju pasauliu. Nors mūsų eksperimentuose nebuvo žmogaus įsikišimo, kad galėtume grynai išmatuoti modelio galimybes, ypač džiaugiamės, kad DI padeda mokslininkams⁠ planuoti eksperimentus ir prisidėti prie mokslo proveržių.

Dirbdami siekiant saugiai ir atsakingai spartinti mokslo pažangą, taip pat siekiame įvertinti ir sumažinti riziką, ypač susijusią su biologiniu saugumu. Šių vertinimų rezultatai rodo, kad modeliai gali samprotauti laboratorijoje tobulindami protokolus, ir tai gali turėti pasekmių biologiniam saugumui, kaip aprašyta mūsų Pasirengimo sistemoje⁠(atsidaro naujame lange). Esame įsipareigoję kurti⁠ būtinas ir niuansuotas apsaugos priemones modelio ir sistemos lygmeniu, kad sumažintume šią riziką, taip pat kurti vertinimus dabartiniams lygiams stebėti.