Að mæla getu gervigreindar til að flýta fyrir líffræðilegum rannsóknum í blautum rannsóknarstofum

Að hraða vísindaframförum er ein verðmætasta leiðin sem gervigreind getur gagnast mannkyninu. Með GPT‑5 erum við farin að sjá fyrstu merki⁠ um þetta — ekki aðeins í því að hjálpa vísindamönnum að fara hraðar í gegnum vísindarit, heldur einnig í því að styðja nýjar leiðir til vísindalegrar rökhugsunar, svo sem að koma upp óvæntum tengslum, leggja til sönnunaraðferðir eða leggja til trúverðuga aðferðir sem sérfræðingar geta metið og prófað.

Framfarir hingað til hafa verið sýnilegastar á sviðum eins og stærðfræði, fræðilegri eðlisfræði og fræðilegri tölvunarfræði, þar sem hægt er að prófa hugmyndir nákvæmlega án eðlisfræðilegra tilrauna. Líffræðin er öðruvísi: flestar framfarir byggjast á tilraunaframkvæmd, ítrun og reynslustaðfestingu á rannsóknarstofu.

Til að skilja betur hvernig frontier-líkan haga sér í þessum aðstæðum, unnum við með Red Queen Bio, sprotafyrirtæki í líföryggismálum, að því að byggja upp matsramma sem prófar hvernig líkan leggur til, greinir og endurtekur hugmyndir í blautum rannsóknarstofum. Við settum upp einfalt tilraunakerfi í sameindalíffræði og létum GPT‑5 fínstilla sameindaklónunarferlið til að auka skilvirkni.

Í mörgum tilraunalotum kynnti GPT‑5 nýja aðferð sem 79-faldaði skilvirkni klónunar. Klónun er grundvallaratriði í sameindalíffræði. Skilvirkni klónunaraðferða er mikilvæg til að búa til stór og flókin söfn sem eru lykilatriði í próteinverkfræði⁠(opnast í nýjum glugga), erfðaskimun⁠(opnast í nýjum glugga) og stofnaverkfræði lífvera⁠(opnast í nýjum glugga). Þetta verkefni býður upp á innsýn í hvernig gervigreind gæti unnið hlið við hlið líffræðinga til að flýta fyrir rannsóknum. Með því að bæta tilraunaaðferðir munu vísindamenn geta unnið hraðar, dregið úr kostnaði og umbreytt uppgötvunum í raunveruleg áhrif.

Þar sem framfarir í líffræðilegri rökhugsun hafa í för með sér afleiðingar fyrir líföryggi, framkvæmdum við þessa vinnu í strangt stýrðu umhverfi — með því að nota góðkynja tilraunakerfi, takmarka umfang verkefnisins og meta hegðun líkana til að upplýsa okkur um áhættumat okkar á líföryggi og þróun öryggisráðstafana á líkana- og kerfisstigi, eins og fram kemur í viðbúnaðarramma⁠(opnast í nýjum glugga) okkar.

Í þessari uppsetningu rökstuddi GPT‑5 sjálfstætt klónunarferlið, lagði til breytingar og innlimaði gögn úr nýjum tilraunum til að leggja til frekari úrbætur. Eina íhlutun manna var að láta vísindamenn framkvæma breyttu aðferðina og hlaða inn tilraunagögnum.

Í margar umferðir fínstillti GPT‑5 klónunarferlið til að auka skilvirkni um meira en 79-falt — sem þýðir að fyrir fast magn af inntaki DNA endurheimtum við 79 sinnum fleiri raðstaðfesta klóna en í grunnlínuferlinu. Það er athyglisvert að það kynnti til sögunnar tvö ensím sem mynda nýjan verkunarmáta: endurröðunarefnið RecA úr E. coli og einþátta DNA-bindandi próteinið (gp32) í faga T4 geninu 32. gp32 vinnur saman að því að slétta og losa um lausa DNA-endana og RecA leiðir síðan hvern þráð að réttri samsvörun.

Þó að þessar niðurstöður séu stutt á veg komnar, eru þær hvetjandi. Úrbæturnar eru sértækar fyrir okkar sérstöku klónunaruppsetningu sem notuð er í líkankerfi okkar, og krefjast samt sem áður þess að vísindamenn setji upp og keyri samskiptareglurnar. Engu að síður sýna þessar tilraunir að gervigreindarkerfi geta aðstoðað raunverulegt rannsóknarstofustarf á marktækan hátt og gætu hraðað þróun vísindamanna í framtíðinni.

Athyglisvert er að AI-rannsóknarstofulykkjan var keyrð með föstum fyrirmælum og engum afskiptum manna. Þessi uppbygging hjálpaði til við að leiða í ljós getu líkansins til að leggja til sannarlega nýjar breytingar á samskiptareglum óháð leiðsögn manna, en hún læsti einnig kerfið við könnun og takmarkaði getu þess til að hámarka afköst nýuppgötvaðra hugmynda. Betra jafnvægi milli könnunar og nýtingar myndi líklega skila meiri ávinningi, þar sem bæði ensím- og umbreytingarúrbætur hafa verulegt svigrúm til úrbóta. Við búumst við að framfarir í skipulagningu og röksemdafærslun um verkefni muni bæta getu einfaldra fastra fyrirmæla til að styðja bæði við uppgötvun og síðari bestun.

Gibson-samsöfnun⁠(opnast í nýjum glugga) viðbragðið hefur verið aðalklónunaraðferðin síðan það var fundið upp árið 2009, með víðtækri notkun í sameindalíffræði. Gibson-samsöfnun gerir sameindalíffræðingum kleift að „líma“ saman DNA-búta með því að bræða endana þeirra stuttlega svo að samsvarandi raðir geti verið innsiglaðar í eina sameind. Einn helsti kostur Gibson-samsöfnunar er einfaldleikinn: allt gerist í einu hólfi við eitt hitastig. Þessar takmarkanir veita eðlilega svigrúm til úrbóta. Auk þess gera eftirfarandi eiginleikar það vel til þess fallið að meta getu gervigreindarlíkans til að bæta blautrannsóknaraðferðirnar:

• Vel skilgreint með stýrðum íhlutum, ólíkt frumubundnu kerfi
• Hefur skýra hagræðingaraðgerð: umbreytanlegt hringlaga DNA búið til úr föstum fjölda línulegra DNA inntaksþátta
• Tiltölulega hraðir tilraunahringir (1-2 dagar)
• Hámargbreytilegt hönnunarrými sem krefst vélrænnar röksemdafærslu til að bæta: besta biðminni, hvarfefni og hitastig eru öll háð hvert öðru.

Við notuðum HiFi assembly⁠(opnast í nýjum glugga), sérhæft ensímkerfi þróað af New England Biolabs og byggt á Gibson-samsöfnun, sem upphafspunkt fyrir hagræðingu. Við könnuðum hvort gervigreind gæti skapað nýjungar og lært af tilraunakenndum viðbrögðum þegar takmörkunum á einþrepi og hitastýringu hefði verið aflétt, og þar með bent á úrbætur á samskiptareglum í þessu tilfelli.

Nánar tiltekið framkvæmdum við tvíþætta klónunarviðbrögð með því að nota gen fyrir grænt flúrljómandi prótein (GFP) og víða notaða pUC19 plasmíðið, staðlað DNA „burðarefni“ sem notað er til að flytja gen inn í bakteríur svo hægt sé að afrita þær. Markmiðið var að fjölga árangursríkum nýlendum.

Við bjuggum til betri klónunarviðbrögð með því að innleiða þróunarramma til að endurtaka tillögur, sem gerir líkaninu kleift að læra „í rauntíma“ af fyrri tilraunum sínum. Í hverri umferð lagði GPT‑5 til hóp með 8-10 mismunandi viðbrögðum, en viðbrögðunum var frestað til síðari umferða ef þau kröfðust sérsniðinna hvarfefna sem rannsóknarstofan hafði ekki tiltæk. Mannlegir vísindamenn framkvæmdu síðan efnahvörfin og mældu fjölda nýlenda miðað við grunnlínu HiFi Gibson-samsöfnunar í fyrstu skimun. Bestu frammistöðugögnin úr fyrri lotu voru síðan sett í næstu lotu. Mikilvægt er að kvaðningin var stöðluð án mannlegs inntaks nema fyrir skýringarspurningar, sem gerir okkur kleift að eigna nýjar vélrænar innsýnir beint til gervigreindar frekar en mannlegrar leiðsagnar. 

Við endurprófuðum átta efstu viðbrögðin úr heildarbestunarröðinni með því að nota breiðara úrval af DNA-þynningum og komumst að því að mörg sýndu minni áhrif en í upphaflegu skimuninni; að lokum var sterkasta staðfesta frambjóðandinn viðbrögð úr umferð 5 sem endurtóku upprunalega frammistöðu sína. Mörg afkastamikil efni tilheyrðu bindiensímjölskyldunni, sem virðist sérstaklega viðkvæm fyrir litlum breytingum á ástandi hæfra frumna og/eða meðhöndlun DNA eftir viðbrögð. Þar sem þessi viðbrögð notuðu stutt HiFi skref, gerum við ráð fyrir að margar afurðir komist líklega inn í E. coli með aðeins einum tengipunkti innsigluðum og hinum haldið með glæðingu, sem skilur eftir björgun niðurstreymis til frumuviðgerðarferla. Þetta skapar mikla dreifni og „gullpotts“-dýnamík: jafnvel þótt afbrigði þessarar viðbragða skili ekki betri árangri í flestum tilfellum, getur einn sterkur útlægur hópur borið fjölskylduna inn í næstu umferðir. 

Þó að við einbeittum okkur að því að hámarka klónunarviðbrögðin í gegnum lotur vegna flækjustigs þeirra, þá hámörkuðum við samhliða umbreytingarferlið með því að nota eina „einstöku“ lotu þar sem líkanið lagði til margar sjálfstæðar breytingar og við völdum viðbrögðin sem skiluðu bestum árangri.

Með því að nota staðlaðar kvaðningar án mannlegs inntaks jók GPT5 79-falt skilvirkni klónunar frá upphafi til enda, staðfest í tilraunaendurteknum prófunum.

Athygli vekur að líkanið lagði til nýja ensímaaðferð, sem það kallaði RecA-Assisted Pair-and-Finish HiFi Assembly (RAPF-HiFi), sem bætir tveimur nýjum próteinum við efnahvarfið: endurröðunarensímið RecA frá E. coli og faga T4 gen 32 einþátta DNA-bindiprótein (gp32). Ennfremur gerði líkanið vísvitandi breytingar á ræktunarhitastigi og tíma, og tímasetningu ensímaukninga: það lagði til að bæta við RecA og gp32 eftir upphaflega 50°C HiFi viðbragðið, láta þessi prótein vinna við 37°C, og fara síðan til baka í 50°C til að ljúka samsetningunni. Saman juku þessar nýju breytingar skilvirkni meira en 2,5-falt. Það skal tekið fram að þetta táknar upphafsafköst án endurtekinnar bestun á viðbragðsskilyrðum og tímasetningu.

Hvað varðar umbreytinguna reyndist áhrifaríkasta breytingin óvænt einföld: að mynda köggla af frumunum (að snúa þeim í skilvindu þannig að þær safnist neðst í rörinu), fjarlægja helminginn af meðfylgjandi rúmmáli og enduruppleysa frumurnar áður en DNA er bætt við, allt við 4°C. Þótt frumur með mikla skilvirkni í efnafræði séu yfirleitt taldar viðkvæmar, þoldu þær styrkingu vel og auknir sameindaárekstrar juku umbreytingarvirkni verulega (>30-falt við lokaprófun). 

Gibsons-samsöfnun virkar þannig að DNA-bútar fá samsvarandi „klístraða“ enda svo þeir geti fundið hvor annan og sameinast. Viðbragðið notar tvö mismunandi ensím (pólýmerasa og lígasa) til að innsigla tengdu hlutana. Í RAPF-HiFi voru tvö prótein kynnt til að bæta samsvörunarferlið. Sú fyrsta, gp32, virkar eins og greiða sem sléttir og leysir úr flækjum á lausum DNA-endum. Sú seinni, RecA, virkar eins og leiðsögumaður sem leitar að rétta félaganum fyrir hvern þráð og dregur saman samsvarandi hluta. Hærra hitastig veldur því að báðar hjálparfrumur losna frá DNA, sem gerir venjulegum Gibson-ensímum kleift að ljúka efnahvarfinu.

Í stuttu máli gerum við ráð fyrir að bætt frammistaða sé miðluð í gegnum eftirfarandi ferli:

• Gp32 húðar óglóða einþátta DNA (ssDNA) hala og fjarlægir aukabyggingu
• RecA, venjulega hindrað af byggingu, ræðst inn frá 3' og ryður gp32 þráðnum úr vegi
• RecA miðlar ssDNA:ssDNA samsvörunarleit⁠(opnast í nýjum glugga), sem stuðlar að samruna
• Að snúa aftur til 50°C færir bæði recA og gp32 þráðina, sem gerir pólýmerasa og lígasa kleift að ljúka efnahvarfinu.

Til að prófa hvort nýju ensímin virkuðu og til að útiloka að afkastabæturnar séu eingöngu knúnar áfram af breytingum á hitastigum eða biðminni, prófuðum við afköst RAPF-HiFi án RecA og án bæði RecA og gp32. Frammistaða beggja efnahvarfa minnkaði miðað við RAPF-HiFi, sem bendir til þess að bæði próteinin séu nauðsynleg fyrir aðgerð RAPF-HiFi.

Þróun RAPF-HiFi bendir til þess að GPT‑5 sé fær um flókna, fjölvídda röksemdafærslu:

• DNA-uppbygging hamlar RecA⁠(opnast í nýjum glugga) og það er athyglisvert að líkanið kynnti til sögunnar tvær samverkandi breytingar í einu: RecA var bætt við og gp32 var bætt við til að fjarlægja aukabyggingu DNA.
• Náttúrulegur félagi E. coli RecA er E. coli einþátta bindiprótein (SSB). SSB gegnir svipuðu hlutverki og gp32 við afritun erfðamengis, endurröðun og viðgerð. Hins vegar losnar E. coli SSB ekki sjálfkrafa af DNA nógu hratt til að RecA-þráðurinn geti vaxið, með RecFOR flókanum sem stuðlar að RecA-myndun við SSB þráð í lifandi frumum⁠(opnast í nýjum glugga). SSB binst sem stöðugur fjórliða með afar hægum losunarhraða⁠(opnast í nýjum glugga). Aftur á móti er gp32-þráður dýnamískari⁠(opnast í nýjum glugga), sem gerir kleift að færa RecA. 

Samkvæmt okkar þekkingu hafa RecA og gp32 ekki verið notuð saman á virkan hátt í aðferðum sameindalíffræði. Eins og með margar nýjar aðferðir í sameindalíffræði, hefur undirliggjandi lífefnafræðileg virkni þegar verið rannsökuð, en notkun þeirra sem hagnýtrar, alhæfanlegrar aðferðar eru framfarirnar.

Til dæmis hefur víxlverkun RecA og gp32 verið rannsökuð í vélrænum in vitro endurbyggingarprófum: í rannsóknum á myndun D-lykkju sýndi sig að gp32⁠(opnast í nýjum glugga) getur aukið virkni RecA. Gp32 hefur verið notað ásamt náttúrulega T4 rekombínasa samstarfsaðila sínum, UvsX, og rekombínasa hleðsluþættinum uvsY í rekombínasa pólýmerasa mögnun (RPA⁠(opnast í nýjum glugga)). Þótt einkaleyfislýsing fyrir RPA segi⁠(opnast í nýjum glugga) að sýnt hafi verið fram á virka RPA-viðbrögð með því að nota E. coli RecA í ólíku kerfi með skertu (þ.e. tilbúnu, ekki villtu) gp32 próteini, birtist þessi fullyrðing aðeins sem tengill í sumum einkaleyfisupplýsingum og, okkur vitandi, hefur hún ekki verið studd af birtum gögnum eða tekið upp sem öflugt RecA-byggt RPA kerfi. Ein klónunaraðferð sem kallast SLiCE⁠(opnast í nýjum glugga) notar heilan frumuútdrátt úr E. coli sem inniheldur λ Red endurröðunarkerfið, þar sem Red beta getur gegnt tvöföldu hlutverki bæði sem DNA-bindandi prótein og endurröðunarasi (þó að við bönnuðum sérstaklega notkun frumuútdráttar í fyrirmælum okkar). Í annarri notkun notuðu Ferrin & Camerini-Otero⁠(opnast í nýjum glugga) RecA eitt sér til að fanga DNA sameindir á sértækan hátt út frá samsvarandi röðum. Auk þesshefur g p32 verið notað sem aukefni⁠(opnast í nýjum glugga) í DNA-mögnunarferli sem kallast PCR til að draga úr annars stigs uppbyggingu. Sýnt var fram á að bæði RecA og gp32 eykur mögnun NABSA⁠(opnast í nýjum glugga) , þó að hvort um sig gæti aukið viðbrögðin sérstaklega og engin samverkandi áhrif fundust. Almennt séð hafa tilgreindar úrbætur á grunnviðbrögðum við DNA-samsetningar í Gibson-stíl verið afar litlar, þar sem þekktasta dæmið er hitastöðugt DNA-bindandi prótein (ET SSB) sem eykur skilvirkni samsetningar um það bil 2,5 falt⁠(opnast í nýjum glugga). 

Fyrir flesta notkun búumst við ekki við að RAPF-HiFi keppi við einfaldleika og áreiðanleika HiFi/Gibson klónunar. Hins vegar er athyglisvert að tilkoma sérstaks samsetningarferlis hefur verið til staðar hvað varðar vélræna eiginleika: GPT‑5 leiddi til lausnar sem inniheldur ókunna samsetningu endurröðunarpróteina og viðbragðsdýnamíkur. Undirliggjandi aðferðin gæti reynst einingunabundin og veitt íhluti sem hægt er að endurnýta eða sameina í öðru sameindavinnuflæði. Við erum einnig að halda áfram að kanna umbætur á RAPF-HiFi. Hægt er að stilla viðbragðshita og lengd skrefa til að vega og meta virkni RecA og gp32 gegn ofmeltingu exonúkleasa, og magn beggja próteina á eftir að hámarka. GPT‑5 hefur einnig lagt til ofvirkt RecA afbrigði, sem við erum að hreinsa núna.

Hvað varðar umbreytingarferlið, þá náðu vel heppnuðu bestunarskilyrðin yfir fjölbreytt aukefni og hitatruflanir sem ætlaðar voru til að auka hitalostsnýtni viðskiptalegra 10-beta hæfra frumna⁠(opnast í nýjum glugga). Af þeim 13 einskiptis umbreytingum sem prófaðar voru með gervigreind, var áhrifaríkasta breytingin, Umbreyting 7 (T7), sem klippti frumurnar í köggla, fjarlægði helminginn af tilteknu rúmmáli og enduruppleysti frumurnar áður en DNA var bætt við, allt við 4°C. Hágæða efnafræðilega hæfar frumur eru yfirleitt taldar viðkvæmar og slík meðhöndlunarskref skal almennt forðast. Engu að síður þoldu frumurnar styrkinn vel. Samanlögð áhrif aukinnar útsetningar fyrir DNA í hverri frumu og minni hamlandi biðminni, sem leiddu til skarpari hitalosts, leiddu til verulegrar aukningar á umbreytingarvirkni (>30-faldrar). 

Þessi umbreytingaraðferð er nýstárleg, þó að greint hafi verið frá svipaðri aðferð⁠(opnast í nýjum glugga) þar sem frumurnar eru einbeittar á fyrra skrefi. Athyglisvert er að aðferðin sem hér er þróuð af GPT‑5 er samhæf við efnafræðilega hæfar frumur sem eru tilbúnar til notkunar, sem útrýmir þörfinni fyrir frumuundirbúning innanhúss, en skilar meiri skilvirkni en tilkynnt hefur verið um með sambærilegum frumustofnum.

Til að auka afköst þessa tilraunakerfis unnu Robot on Rails og Red Queen Bio saman að því að smíða þjarkakerfi sem tekur við klónunarferli fyrir náttúrulegt tungumál og keyrir það í blautri rannsóknarstofu.

Kerfið sameinar þrjá þætti: 1) LLM sem tengir saman mann og þjarka og breytir einföldu orðalagi í aðgerðir þjarka; 2) sjónrænt kerfi sem greinir og staðsetur rannsóknarstofubúnað í rauntíma; og 3) þjarkastýrðan leiðarskipuleggjara sem ákvarðar hvernig á að framkvæma hverja aðgerð á öruggan og nákvæman hátt. Niðurstaðan er sveigjanlegur, alhæfður rannsóknarstofuþjarki sem hefur verið enn frekar fínstilltur fyrir afbrigði af Gibson klónunaraðferðinni.

Við prófuðum hvort sjálfvirki þjarkinn gæti framkvæmt heildstæða klónunartilraun með því að keyra tvær samskiptareglur samtímis: staðlaða HiFi aðferðina og R8, bestu gervigreindarbreyttu samskiptareglurnar úr fyrstu hagræðingarlotunni.

Við bárum saman vinnu þjarkans við tilraunir sem gerðar voru af mönnum í hverju skrefi. Þjarkanum tókst að takast á við umbreytingarferlið með góðum árangri, sem krafðist fjölbreyttra líkamlegra aðgerða: að flytja og blanda vökva, færa sýnatökurör, beita stýrðum hita á frumur og dreifa frumum á vaxtarplötur. Þegar þjarkinn var borinn saman við umbreytingar sem framkvæmdar voru af mönnum, framleiddi hann svipuð gæðagögn með jafngildum framförum frá grunnlínu, sem sýnir snemmbúna möguleika á sjálfvirknivæðingu og flýti fyrir hagræðingu líffræðilegra tilrauna.

Þó að breytingarnar á fjölda tilrauna með þjarka og menn væru svipaðar, voru algerar nýlendutölur úr vélmenninu um það bil tífalt lægri en í handvirkri framkvæmd, sem bendir til sviða sem þarfnast úrbóta, svo sem nákvæmni í vökvameðhöndlun, kvörðun hitastýringar og endurtekningu blæbrigða í handvirkri frumumeðhöndlun.

Við teljum að þessar tilraunir gefi innsýn í hvernig framtíðarvísindi sem hraðað er með gervigreind munu líta út: líkön sem læra stöðugt og hafa samskipti við raunveruleikann. Þó að tilraunir okkar hafi útilokað íhlutun manna til að mæla eingöngu getu líkana, erum við sérstaklega spennt fyrir því að gervigreind hjálpi vísindamönnum⁠ að hanna tilraunir og stuðla að byltingarkenndum rannsóknum.

Þegar við vinnum að því að flýta fyrir vísindalegum framförum á öruggan og ábyrgan hátt, leitumst við einnig við að meta og draga úr áhættu, sérstaklega þeirri sem tengist líföryggi. Niðurstöður þessara mats sýna að líkön geta rökstudd í blautum rannsóknarstofum til að bæta verklagsreglur og geta haft áhrif á líföryggi eins og lýst er í viðbúnaðarramma⁠(opnast í nýjum glugga) okkar. Við erum skuldbundin til að byggja upp⁠ nauðsynlegar og flóknar öryggisráðstafanir á líkans- og kerfisstigi til að draga úr þessari áhættu, auk þess að þróa mat til að fylgjast með núverandi stigum.