Mjerenje sposobnosti umjetne inteligencije da ubrza biološka istraživanja u mokrom laboratoriju

Ubrzavanje znanstvenog napretka jedan je od najvrjednijih načina na koje umjetna inteligencija može koristiti čovječanstvu. S modelom GPT‑5 počinjemo uočavati rane znakove⁠ toga – ne samo u tome što pomaže istraživačima da se brže snalaze u znanstvenoj literaturi, nego i u podršci novim oblicima znanstvenog zaključivanja, poput otkrivanja neočekivanih poveznica, predlaganja strategija dokazivanja ili sugeriranja uvjerljivih mehanizama koje stručnjaci mogu procijeniti i testirati.

Dosadašnji je napredak najvidljiviji u područjima kao što su matematika, teorijska fizika i teorijska računalna znanost, gdje se ideje mogu rigorozno provjeriti bez fizičkih eksperimenata. Biologija je drukčija: većina pomaka ovisi o eksperimentalnoj provedbi, ponavljanju i empirijskoj validaciji u laboratoriju.

Kako bismo bolje razumjeli kako se napredni modeli ponašaju u takvim okruženjima, surađivali smo s tvrtkom Red Queen Bio, startupom za biološku sigurnost, na izgradnji evaluacijskog okvira koji ispituje kako model predlaže, analizira i razvija ideje u mokrom laboratoriju. Postavili smo jednostavan eksperimentalni sustav iz molekularne biologije i prepustili modelu GPT‑5 optimizaciju protokola molekularnog kloniranja s ciljem povećanja učinkovitosti.

Kroz više krugova eksperimentiranja, GPT‑5 je uveo novi mehanizam koji je poboljšao učinkovitost kloniranja za 79 puta. Kloniranje je temeljni alat molekularne biologije. Učinkovitost metoda kloniranja ključna je za stvaranje velikih i složenih knjižnica koje su u središtu proteinskog inženjerstva⁠(otvara se u novom prozoru), genetskih probira⁠(otvara se u novom prozoru) i razvoja sojeva⁠(otvara se u novom prozoru). Ovaj projekt pruža uvid u to kako bi umjetna inteligencija mogla raditi rame uz rame s biolozima kako bi se istraživanja ubrzala. Poboljšanje eksperimentalnih metoda pomoći će ljudskim istraživačima da rade brže, smanje troškove i svoja otkrića pretvore u stvarni učinak u stvarnom svijetu.

Budući da napredak u biološkom zaključivanju nosi implikacije za biološku sigurnost, ovaj smo rad proveli u strogo kontroliranim uvjetima – koristeći benigni eksperimentalni sustav, ograničavajući opseg zadatka te analizirajući ponašanje modela u svrhu procjene biosigurnosnih rizika i razvoja zaštitnih mjera na razini modela i sustava, kako je opisano u našem Okviru pripravnosti⁠(otvara se u novom prozoru).

U tom je okruženju model GPT‑5 autonomno zaključivao o protokolu kloniranja, predlagao izmjene te uvažavao podatke iz novih eksperimenata kako bi predložio daljnja poboljšanja. Jedina ljudska intervencija bila je da znanstvenici provedu modificirani protokol i učitaju eksperimentalne podatke.

Tijekom više uzastopnih ciklusa model GPT‑5 optimizirao je postupak kloniranja te povećao njegovu učinkovitost za više od 79 puta – što znači da smo, uz istu količinu ulazne DNK, dobili 79 puta više sekvencom potvrđenih klonova nego prema osnovnom protokolu. Posebno je važno da je uvedena kombinacija dvaju enzima koji čine nov mehanizam: rekombinaza RecA iz bakterije E. coli i protein gp32, protein bakteriofaga T4 koji se veže na jednolančanu DNK. Djelujući zajedno, gp32 poravnava i raspetljava slobodne krajeve DNK, a RecA potom usmjerava svaki lanac prema njegovu ispravnom paru.

Iako preliminarni, ovi su rezultati ohrabrujući. Poboljšanja su specifična za našu posebnu postavku kloniranja korištenu u našem modelu sustava i još uvijek zahtijevaju da ih ljudski znanstvenici postave i provode protokole. Ipak, ovi eksperimenti pokazuju da sustavi umjetne inteligencije mogu značajno pomoći u stvarnom laboratorijskom radu i možda ubrzati rad ljudskih znanstvenika u budućnosti.

Važno je istaknuti da je petlja AI-laboratorij izvođena uz fiksne upite i bez ljudske intervencije. Takva struktura omogućila je da se razotkrije sposobnost modela da, neovisno o ljudskom vodstvu, predlaže doista nove promjene protokola, ali je istodobno sustav zaključala u istraživački način rada i ograničila njegovu sposobnost da maksimalno iskoristi novootkrivene ideje. Uravnoteženiji dinamički odnos između istraživanja i iskorištavanja vjerojatno bi doveo do većih dobitaka, budući da i enzimska poboljšanja i poboljšanja u transformaciji imaju znatan prostor za daljnje usavršavanje. Očekujemo da će napredak u planiranju i zaključivanju o vremenskom horizontu zadataka poboljšati sposobnost jednostavnih fiksnih upita da podupru i otkrivanje i naknadnu optimizaciju.

Reakcija Gibson assembly⁠(otvara se u novom prozoru) jedna je od glavnih metoda kloniranja još od svojeg uvođenja 2009. godine te je široko prihvaćena u molekularnoj biologiji. Gibson assembly omogućuje molekularnim biolozima da „zalijepe” dijelove DNK tako što se njihovi krajevi nakratko otope, kako bi se podudarne sekvence mogle spojiti u jednu molekulu. Jedna od glavnih prednosti metode Gibson assembly jest njezina jednostavnost: sve se odvija u jednoj epruveti i na jednoj temperaturi. Upravo ta ograničenja prirodno ostavljaju prostor za poboljšanja. Osim toga, sljedeća svojstva čine je posebno pogodnom za procjenu sposobnosti modela umjetne inteligencije da unaprijede tehnike u mokrom laboratoriju:

• Jasno je definirana i temelji se na kontroliranim komponentama, za razliku od sustava koji se oslanjaju na stanice
• Ima jasno definiranu funkciju optimizacije: transformabilna kružna DNK nastala iz unaprijed određene količine linearne ulazne DNK
• Relativno brzi eksperimentalni ciklusi (1-2 dana)
• Visokodimenzionalan prostor dizajna koji zahtijeva razumijevanje temeljnih mehanizama, jer su optimalne puferske otopine, reagensi i temperature međusobno ovisni

Kao polazište za optimizaciju koristili smo HiFi assembly⁠(otvara se u novom prozoru), vlasnički enzimski sustav koji je razvila tvrtka New England Biolabs i koji se temelji na metodi Gibson assembly. Istraživali smo može li umjetna inteligencija inovirati i učiti iz eksperimentalnih povratnih informacija nakon što se uklone ograničenja jedne faze i izotermnih uvjeta, te pritom prepoznati poboljšanja protokola u tom scenariju.

Konkretno, proveli smo reakciju kloniranja s dva fragmenta koristeći gen za zeleni fluorescentni protein (GFP) i široko korišteni plazmid pUC19, standardno DNK „vozilo” za prijenos gena u bakterije kako bi se mogli umnažati. Cilj je bio povećati broj uspješnih kolonija.

Reakciju kloniranja optimizirali smo uvođenjem evolucijskog okvira za iterativno razrađivanje prijedloga, koji je modelu omogućio da „online” uči iz vlastitih prethodnih eksperimenata. U svakom je krugu model GPT‑5 predlagao skup od 8-10 različitih reakcija, pri čemu su se one koje su zahtijevale prilagođene reagense koji u laboratoriju nisu bili odmah dostupni prebacivale u kasnije krugove. Ljudski su znanstvenici zatim proveli reakcije i u početnom probiru izmjerili broj kolonija u odnosu na osnovni HiFi Gibson assembly protokol. Najuspješniji podaci iz prethodnog kruga potom su proslijeđeni u sljedeći krug. Važno je istaknuti da su upiti bili standardizirani, bez ljudskog doprinosa osim pojašnjavajućih pitanja, što nam je omogućilo da nove mehanističke uvide izravno pripišemo umjetnoj inteligenciji, a ne ljudskom vodstvu. 

Ponovno smo testirali osam najboljih reakcija iz cijelog optimizacijskog niza koristeći širi raspon razrjeđenja DNK. Utvrdili smo da mnoge od njih pokazuju slabije učinke nego u početnom probiru. Na kraju se kao najsnažniji potvrđeni kandidat pokazala reakcija iz petog kruga, koja je reproducirala svoju izvornu učinkovitost. Mnogi visoko uspješni kandidati pripadali su tzv. obitelji „ligase-polish”, odnosno protokola koji se oslanjaju na korak ligacije i naknadne dorade DNK, koja se pokazuje osobito osjetljivom na male varijacije u stanju kompetentnih stanica i/ili u načinu rukovanja DNK nakon reakcije. Budući da su te reakcije koristile kratki HiFi korak, pretpostavljamo da mnogi produkti u E. coli ulaze s tek jednim zatvorenim spojem, dok je drugi održan uparivanjem komplementarnih lanaca DNK (annealing), pa se daljnje „spašavanje” prepušta staničnim mehanizmima popravka To stvara veliku varijabilnost i dinamiku „jackpota”: čak i ako većinu vremena varijante ove reakcije ne nadmašuju druge, jedan snažan iznimni rezultat može cijelu obitelj povući u sljedeće krugove. 

Iako smo se, zbog složenosti temeljnih mehanizama, kroz više krugova usredotočili na optimizaciju reakcije kloniranja, paralelno smo optimizirali postupak transformacije koristeći jedan jednokratni („one-shot”) krug u kojem je model predložio velik broj neovisnih izmjena, a zatim smo odabrali reakciju s najboljim rezultatima.

Korištenjem standardiziranih upita bez ljudskog upliva, GPT5 je poboljšao učinkovitost kloniranja od početka do kraja za 79 puta, što je potvrđeno kroz eksperimentalne replike.

Posebno je važno istaknuti da je model predložio novi enzimski postupak, koji je nazvao RecA-Assisted Pair-and-Finish HiFi Assembly (RAPF-HiFi), a koji u reakciju uvodi dva nova proteina. Riječ je o rekombinazi RecA iz E. coli te jednolančanom DNK-veznom proteinu gp32 iz bakteriofaga T4. Osim toga, model je ciljano izmijenio temperaturu i trajanje inkubacije te vremenski slijed dodavanja enzima. Predložio je dodavanje proteina RecA i gp32 nakon početne HiFi reakcije na 50 °C, zatim omogućavanje njihova djelovanja na 37 °C, a potom povratak na 50 °C kako bi se dovršila reakcija. Zajedno, te su nove izmjene povećale učinkovitost za više od 2,5 puta. Valja napomenuti da to predstavlja početnu razinu učinkovitosti, bez iterativne optimizacije reakcijskih uvjeta i vremenskog rasporeda.

Na strani transformacije, najučinkovitija izmjena pokazala se neočekivano jednostavnom: stanice su se taložile centrifugiranjem (odnosno „spuštale” centrifugom kako bi se skupile na dnu epruvete), nakon čega se uklanjala polovica početnog volumena, a stanice su se ponovno vratile u suspenziju u otopini prije dodavanja DNK, sve pri 4 °C. Iako se kemijski kompetentne stanice visoke učinkovitosti obično smatraju osjetljivima, pokazalo se da dobro podnose koncentriranje, a povećan broj molekularnih sudara znatno je povećao učinkovitost transformacije (više od 30 puta u završnoj validaciji). 

Gibson assembly djeluje tako da fragmentima DNK daje odgovarajuće „ljepljive” krajeve kako bi se mogli međusobno pronaći i spojiti. Reakcija koristi dva različita enzima (polimerazu i ligazu) za zatvaranje spojenih fragmenata. U postupku RAPF-HiFi uvedena su dva proteina kako bi se korak sparivanja odvijao učinkovitije. Prvi, gp32, djeluje poput češlja koji zaglađuje i raspetljava slobodne krajeve DNK. Drugi, RecA, djeluje poput vodiča koji traži odgovarajućeg partnera za svaki lanac i privlači podudarne fragmente jedan drugome. Viša temperatura uzrokuje da se oba pomoćna proteina odvoje od DNK, čime se normalnim Gibson enzimima omogućuje da dovrše reakciju.

Ukratko, pretpostavljamo da se poboljšana učinkovitost ostvaruje putem sljedećeg mehanizma:

• Gp32 oblaže neuparene jednolančane repove DNK (ssDNK) i uklanja sekundarnu strukturu
• RecA, koji je uobičajeno inhibiran strukturom, ulazi s 3’ kraja i istiskuje filament gp32
• RecA posreduje u pretraživanju homologije između ssDNK lanaca⁠(otvara se u novom prozoru), čime potiče uparivanje komplementarnih lanaca DNK
• Povratak na 50 °C istiskuje i filament RecA i filament gp32, čime se polimerazi i ligazi omogućuje da dovrše reakciju.

Kako bismo provjerili jesu li novi enzimi funkcionalni te isključili mogućnost da je poboljšanje učinkovitosti posljedica isključivo promjena u temperaturnim koracima ili puferskim otopinama, testirali smo učinkovitost postupka RAPF-HiFi bez RecA te bez oba proteina, RecA i gp32. Učinkovitost obje reakcije bila je niža u odnosu na RAPF-HiFi, što upućuje na to da su oba proteina nužna za mehanizam djelovanja postupka RAPF-HiFi.

Razvoj RAPF-HiFi sugerira da je GPT‑5 sposoban za složeno, višedimenzionalno prosuđivanje:

• RecA je inhibiran strukturom DNK⁠(otvara se u novom prozoru), , a posebno je važno istaknuti da je model istodobno uveo dvije sinergijske izmjene: dodao je RecA te ga nadopunio proteinom gp32, koji uklanja sekundarnu strukturu DNK.
• Prirodni partner rekombinaze RecA iz E. coli jest jednolančani DNK-vezni protein E. coli (SSB). SSB ima sličnu ulogu kao gp32 tijekom replikacije genoma, rekombinacije i popravka DNK. Međutim, E. coli SSB se ne odvaja spontano od DNK dovoljno brzo da bi omogućio rast filamenata RecA, pri čemu kompleks RecFOR in vivo potiče nukleaciju RecA na SSB filamentima⁠(otvara se u novom prozoru). SSB se veže kao stabilan tetramer s iznimno sporim brzinama odvajanja⁠(otvara se u novom prozoru). Nasuprot tome, filament gp32 je dinamičniji⁠(otvara se u novom prozoru), što omogućuje istiskivanje gp32 proteinom RecA.

Prema našim saznanjima, RecA i gp32 dosad nisu bili funkcionalno korišteni zajedno u metodama molekularne biologije. Kao i kod mnogih novih tehnika u molekularnoj biologiji, temeljne biokemijske aktivnosti već su bile istražene, no njihova primjena kao praktične i općenito primjenjive metode predstavlja napredak.

Na primjer, interakcija između RecA i gp32 proučavana je u mehanističkim in vitro rekonstitucijskim testovima: u studijama formiranja D petlje, pokazalo se⁠(otvara se u novom prozoru) da gp32 može pojačati aktivnost RecA. Protein gp32 korišten je u kombinaciji sa svojim prirodnim rekombinaznim partnerom UvsX iz bakteriofaga T4 te faktorom učitavanja rekombinaze uvsY u postupku recombinase polymerase amplification (RPA⁠(otvara se u novom prozoru)). Iako se u specifikacijama patenta za RPA navodi⁠(otvara se u novom prozoru) da su učinkovite RPA reakcije demonstrirane uporabom E. coli RecA u heterolognom sustavu s kompromitiranim (odnosno inženjerski izmijenjenim i neizvornim proteinom gp32) proteinom gp32, ta se tvrdnja pojavljuje tek usputno u nekim patentnim objavama. Prema našim saznanjima, ona nije potkrijepljena objavljenim podacima niti je prihvaćena kao robustan RPA sustav temeljen na RecA. Jedna metoda kloniranja nazvana SLiCE⁠(otvara se u novom prozoru) koristi cijeli stanični ekstrakt iz E. coli koji sadrži rekombinacijski sustav λ Red, pri čemu protein Red beta može imati dvostruku ulogu, i kao DNK-vezni protein i kao rekombinaza (iako smo u našem upitu izričito zabranili uporabu staničnih ekstrakata). U drugoj aplikaciji, Ferrin & Camerini-Otero⁠(otvara se u novom prozoru) koristili su samo RecA za selektivno hvatanje molekula DNK na temelju podudarnih sekvenci. Zasebno, gp32 je korišten kao dodatak⁠(otvara se u novom prozoru) u procesu pojačavanja DNK nazvanom PCR kako bi se smanjila sekundarna struktura. Pokazalo se da NABSA amplifikaciju⁠(otvara se u novom prozoru) poboljšavaju i RecA i gp32, premda svaki može poboljšati reakciju zasebno i nije utvrđena sinergija. Općenitije gledano, zabilježena poboljšanja osnovnih reakcija sastavljanja DNK u stilu Gibson assembly bila su rijetka, a najistaknutiji primjer pritom je toplinski stabilan DNK-vezni protein (ET SSB) koji povećava učinkovitost sastavljanja za približno 2,5 puta⁠(otvara se u novom prozoru). 

Za većinu aplikacija, ne očekujemo da će se RAPF-HiFi moći natjecati s jednostavnošću i robusnošću HiFi/Gibson kloniranja. Međutim, pojava mehanistički različitog puta sastavljanja je značajna: GPT‑5 je došao do rješenja koje uključuje nepoznatu kombinaciju rekombinacijskih proteina i dinamike reakcija. Temeljni mehanizam može se pokazati modularnim, pružajući komponente koje se mogu prenamijeniti ili ponovno kombinirati u drugim molekularnim radnim procesima. Također nastavimo istražiti poboljšanja za RAPF-HiFi. Temperature reakcije i trajanje koraka mogu se prilagoditi kako bi se uskladila aktivnost RecA i gp32 s prekomjernom probavom egzonukleaze, a količine oba proteina još uvijek treba optimizirati. GPT‑5 je također predložio hiperaktivnu varijantu RecA, koju trenutačno pročišćavamo.

Što se tiče protokola transformacije, uspješni uvjeti optimizacije obuhvaćali su niz aditiva i temperaturnih perturbacija osmišljenih kako bi se povećala učinkovitost toplinskog šoka komercijalnih kompetentnih stanica 10-beta⁠(otvara se u novom prozoru). Od 13 jednokratnih transformacija koje je generirala umjetna inteligencija i koje su testirane, najučinkovitija izmjena, Transformacija 7 (T7), uključivala je taloženje stanica, uklanjanje polovice početnog volumena te ponovno vraćanje stanica u suspenziju prije dodavanja DNK, sve pri 4 °C. Kemijski kompetentne stanice visoke učinkovitosti obično se smatraju osjetljivima, zbog čega se takvi postupci rukovanja uglavnom izbjegavaju. Unatoč tome, stanice su dobro podnijele koncentriranje. Kombinirani učinci povećane izloženosti DNK po stanici i manje inhibicijskog pufera, koji je doveo do izraženijeg toplinskog šoka, rezultirali su znatnim povećanjem učinkovitosti transformacije (više od 30 puta). 

Ovaj protokol transformacije je nov, iako je konceptualno sličan pristup⁠(otvara se u novom prozoru) gdje su stanice koncentrirane u ranijoj fazi već prijavljen. Vrijedi istaknuti da je metoda koju je ovdje razvio GPT‑5 kompatibilna s komercijalno dostupnim kemijski kompetentnim stanicama, čime se eliminira potreba za pripremom stanica unutar laboratorija, dok nadmašuje prijavljene dobitke u učinkovitosti sličnog pristupa na usporedivim sojevima stanica.

Kako bi se povećala propusnost ovog eksperimentalnog modela sustava, Robot on Rails i Red Queen Bio surađivali su na izgradnji robotskog sustava koji prima protokol kloniranja na prirodnom jeziku i izvršava ga u mokrom laboratoriju.

Sustav kombinira tri komponente: 1) LLM za komunikaciju između čovjeka i robota koji pretvara običan engleski jezik u radnje robota; 2) sustav za prepoznavanje koji u stvarnom vremenu identificira i lokalizira laboratorijsku opremu; i 3) planera robotskih putanja koji određuje kako sigurno i precizno izvršiti svaku radnju. Rezultat je fleksibilan, generalizirani laboratorijski robot koji je dodatno optimiziran za varijante Gibsonova kloniranja.

Testirali smo može li autonomni robot provesti cjelovit eksperiment kloniranja tako da je istodobno izvodio dva protokola: riječ je o standardnoj HiFi metodi i protokolu R8, najuspješnijem protokolu koji je umjetna inteligencija izmijenila u prvom krugu optimizacije.

U svakom smo koraku uspoređivali rad robota s eksperimentima koje su izvodili ljudi. Robot je uspješno obavio proces transformacije, koji je zahtijevao raznolike fizičke operacije: prijenos i miješanje tekućina, premještanje epruveta s uzorcima, primjenu kontrolirane topline na stanice te razmazivanje stanica po hranjivim pločama. U izravnoj usporedbi s transformacijama koje su proveli ljudi, robot je proizveo podatke usporedive kvalitete uz jednaka poboljšanja u odnosu na osnovni protokol. To pokazuje rani potencijal za automatizaciju i ubrzavanje optimizacije bioloških eksperimenata.

Iako su omjeri promjene između robotskih i ljudskih eksperimenata bili slični, apsolutni brojevi kolonija koje je proizveo robot bili su približno deset puta niži nego pri ručnom izvođenju.To upućuje na prostor za poboljšanja, poput veće preciznosti u rukovanju tekućinama, bolje kalibracije kontrole temperature te vjernijeg oponašanja nijansi ručnih tehnika rada sa stanicama.

Vjerujemo da ovi eksperimenti pružaju presjek onoga kako će izgledati znanost ubrzana umjetnom inteligencijom u budućnosti: riječ je o modelima koji kontinuirano uče i stupaju u interakciju sa stvarnim svijetom. Iako su naši eksperimenti isključili ljudsku intervenciju kako bismo isključivo izmjerili sposobnosti modela, posebno nas raduje potencijal umjetne inteligencije da pomaže znanstvenicima⁠ u osmišljavanju eksperimenata i doprinosi istraživačkim iskoracima.

Dok radimo na ubrzanju znanstvenog napretka na siguran i odgovoran način, također nastojimo procijeniti i smanjiti rizike, posebno one povezane s biozaštitom. Ovi rezultati evaluacija pokazuju da modeli mogu prosuđivati u mokrom laboratoriju kako bi poboljšali protokole, i mogu imati implikacije za biološku sigurnost kako je opisano u našem Okviru pripravnosti⁠(otvara se u novom prozoru). Posvećeni smo izgradnji⁠ potrebnih i nijansiranih zaštitnih mjera na razini modela i sustava kako bismo smanjili ove rizike, kao i razvoju evaluacija za praćenje trenutnih razina.